學位論文
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Item 桑葉萃取物及活性成分對抗親聚集Tau中介發炎和粒線體功能障礙的潛力(2023) 曾沛瑄; Tseng, Pei-Hsuan阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病，其特徵包括大腦中堆積的Amyoild β斑塊及Tau蛋白聚集的神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles, NTF)，影響突觸和認知功能。神經纖維纏結主要由過度磷酸化的Tau蛋白組成，該蛋白會自我聚集並失去微管穩定功能。Tau聚集體可活化小膠質細胞使其釋放發炎因子，並進一步促進神經元中Tau蛋白過度磷酸化。此外，過度磷酸化的Tau蛋白會破壞線粒體功能，從而導致突觸功能障礙。因此，減少小膠質細胞介導的神經炎症，可能有利於改善病理性Tau介導的線粒體功能障礙。由於桑葉(Morus alba L.)已被報導具有抗氧化和抗炎活性，因此本研究聚焦在桑葉萃取物及其七種報導的抗氧化成分。通過HPLC分析桑葉萃取物的化學特徵，色譜圖顯示對應於槲皮素-3-O-芸香苷(QR)、槲皮素-3-O-葡萄糖苷(QG)、山奈酚-3-O-葡萄糖苷(KG)、綠原酸(CGA)和隱綠原酸(4-CQA)的峰值。MTT細胞活力測定顯示桑葉萃取物及其活性成分對BV-2和SH-SY5Y細胞的細胞毒性非常低(IC50大於10 mg/ml或100 μM)。所有七種測試化合物在生化測定中均表現出自由基清除活性和/或氧自由基吸收能力。本研究利用大腸桿菌製備His標記的ΔK280 Tau重複結構域(TauRD)原纖維(Fibril)，並且在冷凍電子顯微鏡(Cryo-TEM)下觀察到寡聚的Tau聚集體。生化硫黃素T螢光測定顯示，QR、QG、槲皮素-3-O-(6-乙酰基)-葡萄糖苷(QAG)、CGA和4-CQA可顯著減少ΔK280 Tau蛋白的聚集。製備的ΔK280 Tau原纖維誘導BV-2微膠細胞活化，這一點可通過細胞型態的改變、一氧化氮(NO)產生的增加和細胞中IBA1和MHCII的表達增加來揭示。桑葉萃取物可以抑制NO、IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎介質的產生，並降低BV-2細胞中NLRP3發炎小體及凋亡蛋白酶-1的活化。收集激活的BV-2細胞的條件培養液(Condition media)，並應用於ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞引發細胞炎症，桑葉萃取物能降低細胞釋放乳酸脫氫酶、減少細胞活性氧的產生來減輕粒線體損傷、並增加神經突的生長，達到神經保護作用。該研究結果可能支持桑葉萃取物作為改善AD疾病症狀的新療法的概念。Item 中藥複方製劑芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物在Tau蛋白易聚集表現之阿茲海默氏症細胞模式中之療效(2022) 林德嫻; Lin, Te-Hsien阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)為一種進行性且不可逆的神經退化性疾病，受損的記憶和認知能力會逐漸失常最終造成身體功能的完全喪失。AD病人腦中最主要的特徵為不正常的Amyoild β與Tau蛋白聚集形成的老化斑塊(Senile plaque)和神經纖維纏結(Neurofibrillary tangles)。神經纖維纏結主要組成是高度磷酸化的Tau蛋白，而Tau蛋白的病變不僅在AD病人，也在許多Tauopathy中見到。在大腦中由於錯誤折疊形成的蛋白堆積，引發許多病理事件，例如氧化壓力、神經發炎，或是與神經細胞功能相關的訊息傳遞障礙，降低神經細胞存活。本篇研究主要是利用人類胚胎腎細胞HEK-293和神經纖維瘤母細胞SH-SY5Y，表現易聚集特性的ΔK280 TauRD片段蛋白，作為評估中藥製劑芍藥甘草湯(SG-Tang)以及Coumarin-chalcone衍生物LM-021、LM-031和LMDS-1~4化合物，抑制蛋白聚集、抗氧化和神經保護性的情形。芍藥甘草湯製劑，由甘草與白芍以等比例製成，除了可有效降低以LPS/IFN-γ刺激後活化的BV-2微膠細胞所釋出的NO、TNF-α、IL-1β及IL-6等前驅發炎細胞因子外，並可抑制由於誘導表現ΔK280 TauRD蛋白而上升的BAD、BID、CASP3、CASP8和CYCS表現，來達到Tau蛋白聚集抑制和神經保護性。其中LM-021除了本身有化學伴護活性可直接抑制ΔK280 TauRD的聚集外，還可透過PKA、CaMKII、ERK等路徑活化CREB和下游的BDNF、BCL2表現，來展現其神經保護之功能。接著在ΔK280 TauRD-DsRed SH-SY5Y細胞中，觀察到LM-031可提升HSPB1伴護蛋白表現以降低Tau蛋白的錯誤折疊，以及藉由活化NRF2/NQO1/GCLC和CREB調控之BDNF/AKT/ERK/BCL2路徑，來達到抑制細胞凋亡和促進細胞存活之效果。最後，因LM-031可提升CREB依存的BDNF表現，利用虛擬篩選找出LM-031類似化合物LMDS-1~4，並進一步以TRKB與ligand作用的d5-domain (PDB 1hcf)，以分子模擬計算LM-031類似化合物與此蛋白片段的結合構形。細胞實驗結果顯示，LMDS-1和LMDS-2可經由TRKB/ERK和TRKB/PI3K/AKT訊息路徑，增加CREB磷酸化及其下游BDNF、BCL2基因表現。總結來說，本研究結果顯示芍藥甘草湯的抗氧化和抗發炎活性，可抑制神經細胞凋亡，在Tau蛋白聚集的細胞中展現其神經保護的能力，而Coumarin-chalcone衍生物LM-031、LM-021、LMDS-1、LMDS-2，具有活化HSPB1、NRF2及/或TRKB的作用，來降低Tau蛋白的錯誤摺疊、抑制細胞凋亡和促進神經細胞存活。以上這些研究結果顯示了芍藥甘草湯和Coumarin-chalcone衍生物，應用在AD治療上的潛能。Item 評估TrKB之潛力促效劑於阿茲海默氏症細胞與動物模式之神經保護效果(2019) 范家豪; Fan, Chia-Hao阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease, AD)是目前最常見的神經退化性疾病之一，至今尚無顯著有效的治療方法。這種全球性的健康問題不論是對於個人或社會都有極大的影響。AD在病理學上主要有兩個病徵：類澱粉蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)堆積成的斑塊(plaques)以及Tau蛋白過度磷酸化所導致的神經纖維糾結(neuro-fibrillary tangles, NFTs)。許多研究證實，在失智症病患腦中之腦源性神經滋養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)濃度較低，且此現象可令更多的Aβ生成。BDNF及其受體原肌球蛋白相關激酶B(tropo-myosin-related kinase B, TrkB)，可調節長期增益效應(LTP)、長期抑制效應(long-term depre-ssion, LTD)、軸突出芽、樹突增生、突觸可塑性和神經元分化。7,8-二羥基黃酮(7,8-dihydroxyflavon, 7,8-DHF)是目前已知的TrkB促效劑，可與細胞膜上的TrkB受體結合並引發同源二聚化，啟動下游之訊息傳導。本研究是使用結構與7,8-DHF類似之12種新型的TrkB促效劑，經過MTT實驗評估發現12種促效劑對神經細胞都無明顯細胞毒性及神經突生長之影響。接著於小鼠海馬迴細胞初級培養給予Aβ25-35誘導神經損傷作為AD模式篩選平台，結果顯示LMDS-1能有效緩解因Aβ25-35寡聚體所導致的神經突長度及分支數目降低之現象，因此選擇LMDS-1進入動物實驗測試，並以7,8-DHF為正控制組。先利用立體定位注射Aβ25-35至小鼠海馬迴CA1區域以建立AD模式動物，再給予7,8-DHF或LMDS-1之處理，並於期間進行一系列行為實驗，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的短期及長期記憶受損。在病理分析上，我們利用免疫組織化學染色和西方墨點法分析小鼠海馬迴組織，結果顯示LMDS-1可有效改善因Aβ25-35誘導所導致的Aβ堆積、成熟神經細胞缺失、pERK及synaptophysin表現量降低。由病理分析結果推論，LMDS-1可能是經由pY516TrkB活化Ras/MAPK路徑來激活CREB轉錄因子，進而上調mBDNF之表現量，改善因Aβ25-35所導致的記憶缺失。綜合上述結果，LMDS-1是具有治療AD潛力的新型TrkB促效劑，能夠改善動物記憶功能，並緩解AD代表性之病理特徵，希望能為日後AD研究提供一些新的方向與目標。Item 研究果蠅PP2A B次單元twins的功能以及和Tau蛋白的交互作用(2010) 葉柏安; Po-An YehPR55Bbeta的表現異常，長久以來一直被認為是小腦萎縮12型的致病原因。隨後的研究指出，PR55Bbeta的表現量增加，極可能是小腦萎縮12型的致病原因。然而，可以模擬小腦萎縮12型的動物模式，一直沒被建立，以其在生物體內的致病機轉仍不明確。在本研究實驗中，PR55Bbeta過渡表現的果蠅模式被建立，而且其果蠅表現出運動力下降和神經病變的特徵。在研究PR55Bbeta和Tau蛋白之間的作用時，我意外的利用果蠅背甲上毛的數目，建立一個新穎的模式系統，可以穩定的檢測出Tau蛋白的磷酸化程度。研究期間，我更發現，磷酸化的Tau蛋白，有保護神經的功能，並且延長果蠅的壽命。相反的，無法磷酸的Tau蛋白，對神經的發育有不好的影響。最後，本研究也指出，PP2A的B次單元與細胞骨架的調控有關，為一個新發現的嶄新的功能。也許這些研究成果，可以連結小腦萎縮12型和阿茲海默症之間致病機轉的關連。Item 降低組蛋白去乙醯酶活性減緩果蠅模式之Tau蛋白神經毒性之研究(2015) 黃昱嘉Tau是一個被大量表現在中樞神經系統之中的蛋白，其功能為穩固神經細胞之中微管的結構，並維持神經系統的完整性。Tau蛋白在過度磷酸化及不正常聚集會造成許多退化性神經疾病通稱為”tauopathies”。這些疾病包括了阿茲海默氏症以及額顳葉失智症。由於研究顯示基因轉錄失調為tauopathies 的致病機轉之一，且抑制組蛋白去乙醯酶可改善上述病徵。因此本研究的目的在於利用果蠅模式，藉由組蛋白去乙醯酶抑制劑及核酸干擾檢驗上述推論。我們先前研究發現在果蠅過量表現人類的Tau蛋白會造成背甲上的剛毛缺少，利用此一模式以核酸干擾的方式，發現降低果蠅的組蛋白去乙醯酶的表現能有效的抑制因Tau蛋白表現所造成剛毛缺失的現象，同樣地，利用一些新穎的組蛋白去乙醯酶抑制劑也可以達到改善剛毛生長的情況，進一步我們發現核酸干擾及抑制劑的處理可增加組蛋白H3的乙醯化。而核酸干擾及組蛋白去乙醯酶抑制劑的處理會降低Tau及Tau磷酸化的表現以及提升Tau的溶解度。然而核酸干擾及部分組蛋白去乙醯酶抑制劑可增加Tau果蠅模式的壽命。綜合上述發現，我們認為降低Tau蛋白的表現量和磷酸化及增加組蛋白H3的乙醯化，可能對病徵有改善的作用。Item 遺傳背景對於阿茲海默氏症模式小鼠之影響(2019) 柯雅云; Ko, Ya-Yun阿茲海默氏症為一種最常見的失智症，分為兩種類型：早發性的家族遺傳型阿茲海默氏症(Familial Alzheimer’s disease, FAD)及晚發性的偶發型阿茲海默氏症(Sporadic Alzheimer’s disease, SAD)。家族遺傳型阿茲海默氏症是因為基因的突變所導致，如：類澱粉蛋白前驅蛋白(amyloid precursor protein, APP)、早老素(Presenilin-1, PS1、Presenilin-2, PS2)的突變；而偶發型阿茲海默氏症可能受環境、飲食習慣、壓力及年紀等因素影響。阿茲海默氏症主要的病徵有β類澱粉蛋白(Aβ)堆積在細胞外形成類澱粉斑塊，及tau蛋白過度磷酸化導致神經細胞內的神經纖維糾結，而這些最終都會導致神經細胞的死亡。在過去幾十年，臨床的實驗只能夠延緩阿茲海默氏症病程的發展，卻無法有效的治療這個疾病。良好的動物模式對於實驗的進行是十分重要的，但在實驗室以往的經驗中我們發現B6.129-Psen1tm1Mpm Tg (APPSwe, tauP301L) 1Lfa/J這種3基因轉殖鼠所顯現的性狀並不明顯，而且不容易準備相同遺傳背景的野生鼠作為實驗控制組。為了要有一個更具代表性的實驗動物，我們將此基因轉殖鼠的品系從B6.129雜交品系回交配成B6的純品系，並以行為實驗進行B6純品系3基因轉殖小鼠短期記憶、長期記憶、焦慮、運動能力的評估。我們發現B6.129雜交3基因轉殖小鼠不論在6、9、12、18月大，運動能力都顯著低於野生型B6小鼠及B6純品系 3基因轉殖小鼠，而B6純品系 3基因轉殖小鼠與野生型B6小鼠之間沒有顯著的差異，但在焦慮行為測試中顯示B6.129雜交鼠較無焦慮情形。另外利用西方墨點法測量小鼠海馬迴各種蛋白質的表現量，我們發現12月大B6.129雜交3基因轉殖小鼠及18月大B6純品系3基因轉殖小鼠則在Aβ的表現量相較於野生型小鼠有顯著的上升。Tau蛋白的表現量及202、396位點磷酸化程度則是兩種品系的3基因轉殖小鼠從6月大起都顯著的高於野生型小鼠，而腦片染色結果也可以發現B6純品系3基因轉殖小鼠及B6.129雜交3基因轉殖小鼠從9個月大開始其Tau蛋白202位點的螢光強度就顯著的高於野生型小鼠。除此之外，在檢查多種磷酸化Tau蛋白的激酶後我們發現12及18月大B6品系的3基因轉殖小鼠pERK的表現量顯著的高於野生型及B6.129雜交3基因轉殖小鼠，我們發現pERK的訊號與NeuN的訊號有共表現的狀況，確認ERK的活化是在神經細胞中，因此我們認為Tau蛋白的磷酸化可能是經由ERK活化所引起的。而利用腦片染色方式檢測小鼠腦中Iba1及GFAP數量發現三組小鼠間微膠細胞及星狀膠細胞數量差異不大，因此我們認為B6純品系3基因轉殖小鼠及B6.129雜交3基因轉殖小鼠沒有膠細胞過度增生的情況。我們在行為測試中發現B6.129雜交3基因轉殖小鼠發病情形較為嚴重，但在蛋白質含量測試上發現B6品系3基因轉殖小鼠tau磷酸化程度較高。因此，未來需要進一步確認B6品系3基因轉殖小鼠在阿茲海默氏症上研究的可行性。