Browsing by Author "李桂楨 博士"

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    GAS7基因於肺癌之分子變異及臨床相關性研究
    (2008) 陸一麟; LU, YI-LIN
    自1982年起，癌症即為台灣地區十大死亡原因之第一位，其中肺癌不論在女性或男性都高居癌症死亡率的首位，儘管目前醫學已相當進步，但對於分子致癌機制仍未完全釐清。目前所知，癌症形成的原因，是由於多重基因發生變異所造成，其中大家所熟知和癌症有關的為抑癌基因 (tumor suppressor gene) 及致癌基因 (oncogene)。因此，抑癌基因變異的研究有助於了解癌症形成的機制。 研究目的：Growth arrest-specific 7 (GAS7) 這個蛋白質為GAS這個基因家族的其中一個成員，主要功能可能與調控細胞週期有關；前人研究報導顯示，GAS7可能在細胞中扮演一抑癌基因的角色。因此，本研究目的在探討GAS7基因在台灣地區非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer) 病人細胞中之變異情形：利用免疫組織化學染色法，觀察病人組織切片中GAS7蛋白表現情形，再以反轉錄—聚合酵素鏈反應分析組織細胞中mRNA轉錄是否異常，續以甲基化為基礎的定序反應以及微衛星基因座鑑定法分別偵測GAS7基因的促進子過度甲基化頻率和基因座缺失頻率。 結果: 本研究以免疫組織化學染色法發現75位NSCLC病人中GAS7蛋白低表達頻率為57.3% (43/75)，以31位病人之組織進行西方轉漬法發現三種主要的蛋白形式，分別依分子量大至小為GAS7C、7B和7A，其GAS7C蛋白低表現之比例為48.4% (15/31)，GAS7B蛋白低表現之比例為40.7% (11/27)，而GAS7A蛋白幾乎不表現；GAS7 mRNA isoform: GAS7C和GAS7B低表達頻率分別為20.9% (19/91)和32.6% (30/92)，而GAS7C和7B啟動子甲基化頻率分別為16.7% (6/36) 和65.6% (21/32)。GAS7基因座缺失的頻率在位於基因上、下游兩微衛星序列取聯集後為20.7% (18/87)。GAS7蛋白質/mRNA、GAS7C和7B之mRNA/啟動子甲基化的數據彼此間都呈現統計上的顯著相關性 (P<0.05)。利用西方轉漬膠片中相對於GAS7C分子量之蛋白進行膠體內水解、trypsin反應及質譜分析，本研究證實其為GAS7C蛋白。同時，我們藉由不同肺細胞株一系列的基因及蛋白質實驗，我們發現GAS7蛋白不同isoforms如GAS7C和7B，表達的量與細胞內的位置也都不同。 結論：本研究證實GAS7基因在台灣地區肺癌形成過程中扮演一個類似抑癌基因的角色，其中GAS7C為主要的變異蛋白，其變異主要機制為啟動子過度甲基化及基因座缺失，而 GAS7C 蛋白則可以在生長較為緩慢之正常肺細胞表現，此研究也是首篇證實GAS7C isoform可以在人類細胞中表現之論文。
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    人類遺傳疾病 第一部份：第八型脊髓小腦共濟失調症之分子遺傳及外遺傳研究 第二部份：台灣兩個Netherton徵候群病患家族之分子遺傳研究
    (2006) 黃淑宜; Shu-Yi Huang
    第一部份： 第八型脊髓小腦共濟失調症(SCA8)為退化性神經疾病，其特徵為小腦功能異常或亦包含其他部位的神經性異常，此疾病和染色體13q21位置的SCA8基因3'端CTG三核重複擴增相關。自1999年以來，SCA8基因的CTG擴增突變見於遺傳性及偶發性的運動失調患者，及帕金森氏症(PD)、阿茲海默氏症(AD)、Friedreich's運動失調症等退化性神經疾病及精神病患，甚至於極少數正常人。SCA8基因表現於腦的各部位，但轉錄的RNA裁接後並不具open reading frame。在人類及老鼠基因體中，SCA8基因的5'端皆和緊鄰的KLHL1基因(actin結合蛋白)的5'端互補，即SCA8轉錄物和KLHL1轉錄物互為antisense RNA，故SCA8基因可能藉此antisense RNA，來調節KLHL1基因的表現。先前本實驗室對SCA8致病基因進行遺傳分析，亦在台灣人的PD患者中發現的CTG重複擴增的現象(Wu et al., 2004)。本研究利用PCR-genotyping及DNA定序技術，擴大分析正常人族群、運動失調症患者、PD患者、AD患者及其他神經疾病族群SCA8基因CTG重複變異，結果共發現8位個體具CTG重複擴增的對偶基因，包括1位正常人、2位運動失調症患者、1位肌張力異常症患者、1位泛發性路易體患者及3位PD患者。RT-PCR分析正常人和CTG重複擴增病患的淋巴細胞株，發現SCA8基因和KLHL1基因皆有表現。進一步利用甲基化專一的PCR檢測及限制酵素的甲基化檢測，分析SCA8基因和KLHL1基因重疊序列上的CpG島的甲基化情形，發現在正常人和SCA8基因CTG重複擴增患者細胞中，均有不同程度的甲基化情形，但和SCA8基因CTG重複並無絕對相關性。在氧化壓力相關研究中，經由氧化劑t-butylhydroperoxide (TBH) 處理後，正常人及SCA8基因CTG重複擴增患者淋巴細胞株的WST-1細胞增生檢測、Trypan blue排除檢測、Superoxide dismutase assay結果，皆無明顯差異，故推論SCA8基因CTG重複擴增，並未影響細胞株的抗氧化能力。 第二部分： Netherton Syndrome (NS)是一種嚴重的體染色體隱性遺傳皮膚疾病，特色是先天性的紅皮症(congenital erythroderma)、特殊不正常的髮根結構(bamboo hair)及伴隨著體內IgE濃度提高的過敏性表現(atopic manifestations)。NS的病因是由於體內缺少絲胺酸蛋白抑制因子(serine protease inhibitor)的活性，而造成體內絲胺酸蛋白(serine protease)的活性異常提高。到目前為止，NS還沒有非常好的治療方法。NS的致病基因在2000年時被發現，位於染色體5q31-32的SPINK5 (serine protease inhibitor Kazal-type 5)基因，大小為61 kb，含有33個外顯子，其產物LEKTI蛋白，是一種絲胺酸蛋白抑制因子，廣泛的表現在人體各組織中，含有1064個胺基酸，有十五個potential inhibitory Kazal-type domains (D1–D15)，包括典型的Kazal-type domain D2和D15。和NS相關的SPINK5基因突變類型主要是產生了前成熟終止密碼(premature termination codon)，造成mRNA的不穩定，而使產物蛋白LEKTI (lympho-epithelial Kazal-type related inhibitor)的生成遽減。本研究目的為探討台灣兩個NS病患家族之分子致因。藉著PCR、定序來檢視兩位患者包括啟動子在內的SPINK5基因，找出和患者性狀相關的基因突變，並利用鄰近之6個微衛星序列及SPINK5基因上的5個SNP，對患者270家族進行連鎖分析。結果在患者2567的外顯子25上找到兩個突變點：已報導過的R790X及新發現的T808I，分別遺傳自患者的父親及母親。另一患者270為一新發現的R267Q變異的同型合子，此變異的Q對偶基因在正常人族群中約佔31%，但患者父親並未帶有此變異。進一步利用同步定量PCR (real-time PCR)，來檢測患者270是否有缺失突變(deletion)，結果顯示患者270在外顯子10的DNA套數和其啟動子鄰近序列(CA)20及D5S2013(為異型合子)相同，即排除其發生缺失突變的可能性。對於患者270在不符合遺傳定律之R267Q位點，推論可能發生基因轉換(gene conversion)。
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    以tau 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略
    (2013) 陳炫江; Hsuan-Chiang Chen
    阿茲海默氏症是一種漸近性的神經退化性疾病，主要病理特徵包 括細胞外間質的Aβ 胜肽堆積，及細胞內高度磷酸化tau 形成的神經 纖維糾結。由於tau 聚集與阿茲海默氏症進程具相關性，因此透過抑 制或消除tau 聚集或可保護受影響之神經細胞。本研究構築tau 蛋白 微管結合重複區域(tauRD)之野生型(K18)及第280 位置賴胺酸缺失的 促tau 聚集突變型(ΔK280)與DsRed 紅螢光蛋白融合之tauRD-DsRed基因，來建立誘導表現tauRD-DsRed 之Tet-On 293 與Tet-On SH-SY5Y 細胞，作為藥物篩檢平台，來篩檢可抑制tauRD 聚集的抑制物，並對 這些具聚集抑制性的化合物或中草藥、植物萃取物等，檢測其神經保 護機制。在Tet-On 293 細胞誘導tauRD-DsRed 蛋白表現後，ΔK280 突變型細胞螢光亮度較野生型細胞顯著減少。以剛果紅(正控制組)處 理細胞後，突變型細胞的紅螢光亮度較野生型者更能有效提升。對於 293 促tau 聚集突變型細胞，在細胞數無顯著影響下， 前處理 NC009-1、-2、-3、-6、-7 (吲哚基喹啉化合物)、NTNU-003、-008 (GSK-3β抑制劑類似物)、NH021、NTNU-043、-057、-059、-224、NTNU-309、 -313、-319、-331、-379 (中草藥或植物萃取液)等皆可顯著提升DsRed 紅螢光亮度。以維他命A 酸誘導ΔK280 促tau 聚集突變型SH-SY5Y 細胞神經分化後，螢光顯微影像分析顯示神經突觸生長性狀(包含總 生長及突起數、分支數)較野生型K18 細胞顯著下降。以NC009-1、 -7 及NTNU-008 前處理突變型SH-SY5Y 細胞後，可顯著提升神經突 觸總生長性狀，並可提升HSP27 蛋白(NC009-1、-7)或GRP 78、HSP27 蛋白(NTNU-008)的表現。
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    第十七型脊髓小腦運動失調症:遺傳檢測及發展生化暨酵母菌的藥物篩檢模式
    (2007) 黃慧茹
    脊髓小腦運動失調症(Spinocerebellar ataxia，簡稱SCA)是一群漸進性神經退化疾病，其大多是由於三或五核苷酸重複擴增所致，主要臨床症狀包括動作失調及發音障礙，主因是小腦退化及萎縮，目前計有28種之多。第十七型脊髓小腦運動失調症(SCA17)是位於染色體上6q27位置的TATA binding protein (TBP)基因CAG三核苷重複擴增所引起的神經退化性疾病。TBP基因所做出來的蛋白為細胞內重要的轉錄調節因子，而擴增的多麩醯胺(polyQ)可能影響TBP蛋白的功能。根據許多研究顯示帶有多麩醯胺擴增的蛋白會傾向於形成不溶解的聚集物(detergent-insoluble aggregate)，進而造成神經細胞的功能異常、病變或死亡。針對TBP基因上CAG三核苷重複次數的族群研究顯示，在正常人族群中，TBP基因CAG三核苷重複次數大都為25~42，在家族性及偶發性的運動失調患者中，所發現的CAG三核苷擴增次數為43~66。本論文首先對長庚醫院神經內科所提供的正常人(197位)、運動失調症(ataxia)患者(13位)、帕金森氏症(Parkinson's disease)患者(103位)、失智症(dementia)患者(122位)、原發性顫抖症(essential tremor)患者(101位)及其他神經疾病患者(舞蹈症、肌張力異常症等，29位)進行SCA17 CAG三核苷重複擴增的分子檢測，結果並未發現任何擴增的等位基因，各族群中皆以36個重複序列的等位基因最常見。本研究的第二部份擬建立生化及酵母菌藥物檢測模式，在生化模式上先後製備了包含3~61個僅包含多麩醯胺鏈(GST-Qn)及包含多麩醯胺的不完整N端TBP (GST-tTBP-Qn)、完整N端TBP (GST-nTBPQn)、全長TBP (GST-fTBPQn)的GST融合蛋白，利用filter-trap assay及Western blot方法作為藥物測試，但可能因為TBP蛋白的溶解性及1C2抗體的適用性，控制組及待測組藥物皆無法有效抑制帶有多麩醯胺擴增蛋白的聚集。另外在酵母菌藥物篩檢模式上，製備了兩組不完整N端TBP (tTBP-Qn-EGFP)、完整N端TBP (nTBP -Qn-EGFP)綠螢光融合蛋白，表現於不同品系的酵母菌中，在半乳糖誘導融合蛋白表現模式下，可能原因為多麩醯胺的長度未達到影響酵母菌生長的長度，或半乳糖誘導效果不佳，表現多麩醯胺擴增綠螢光融合蛋白(tTBP-Q54-EGFP、nTBP-Q48-EGFP)的酵母菌，其生長與控制組(tTBP-Q20-EGFP、nTBP-Q20-EGFP)相較，並無差異。本篇論文提供發展生化及酵母菌藥物篩檢模式雖未達到預期結果，仍可提供未來相關研究的參考。