Browsing by Author "謝翊萱"

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    香菸致癌物透過AKT/GSK3β/βTrCP訊息路徑影響DNA甲基轉移酵素穩定性
    (2008) 謝翊萱; Yi-Shuan Hsieh
    研究背景:台灣地區不論女性或男性肺癌皆高居癌症死亡率之首位，而肺癌的發生與長期暴露於環境中的致癌物質有關，尤其是香菸中的成份nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，簡稱NNK，被認為是造成肺癌主要的致癌物類型之一。NNK除了會導致DNA 的損害 (DNA damage) 外，近來研究也發現NNK 容易造成癌症形成過程中外顯基因變異 (epigenetic alteration)，使抑癌基因的啟動子上被過度甲基化。而造成啟動子CpG 位置上過度甲基化的DNA 甲基轉移酵素 (DNA methyltransferase, DNMT)DNMT1、DNMT 3a 及DNMT 3b，目前也已發現在癌細胞中有過度表現的情形。 研究目的: 本實驗室先前針對肺癌做了許多與抑癌基因CpG 過度甲基化相關的研究，並發現DNMTs 的過度表達與抽煙的肺癌病人有顯著的相關性，然而造成此現象的詳細機制仍不清楚。因此本篇研究目的為以細胞、臨床及動物模式探討香菸致癌物NNK 是透過何種機制而誘導DNMTs 表達，進而導致許多抑癌基因啟動子CpG位置過度甲基化的現象。 研究方法及結果: 首先在細胞模式由西方轉漬法 (Western Blot)發現處理香菸中的尼古丁 (nicotine) 6 小時後，會促使DNMT1 蛋白表現增加；而由nicotine 所衍生出來的致癌物NNK 則是在隨其處理濃度及時間增加，DNMT1 蛋白表現也隨之增加，尤其在10 μM NNK處理2 小時即有很明顯誘導效果；同時藉由外送DNMT1 載體表現分析實驗也得知NNK 會誘導外生性DNMT1 蛋白表現增加；然而透過反轉錄聚合酵素鏈反應 (RT-PCR) 得知NNK 處理2 小時並不會影響DNMT1 mRNA 的表達改變。進一步，處理可以抑制新蛋白質生成的轉譯抑制劑Cycloheximide 得知DNMT1 蛋白的半衰期大約6小時，但是同時受到NNK 刺激後，DNMT1 蛋白的半衰期增長為24 小時。本研究結果亦顯示nicotine 及NNK 在2 小時內與p-NFκB、p-AKT、p-ERK1/2 及p-p38 的訊息蛋白活化有關；更進一步由處理AKT抑制劑 (LY294002) 及AKT knock down 實驗得知NNK會透過AKT 訊息路徑影響DNMT1 蛋白表現的增加。由免疫沈澱法(Immunoprecipitation)、蛋白質降解抑制劑 (MG132) 處理等實驗證明NNK透過AKT訊息路徑影響泛素 (ubiquitin) 調節的蛋白質體降解系統而增加DNMT1 蛋白的穩定性；此外，更進一步利用GSK3β抑制劑及分別外送GSK3β、βTrCP 載體表現來驗證GSK3β/βTrCP路徑會促使DNMT1 蛋白降解，但NNK 則會活化AKT 而影響 GSK3β/βTrCP 路徑使DNMT1 不易被降解。由免疫沈澱法也首度證實DNMT1 蛋白會與GSK3β 及 βTrCP 蛋白結合，由此可知GSK3β/βTrCP 蛋白降解路徑的確會影響DNMT1 蛋白調控。接下來我們以染色質沈澱的聚合酶鏈鎖反應(chromatinimmunoprecipitation-polymerase chain reaction assay) 及聚合酵素鏈反應為基礎的甲基化分析 (methylation-specific PCR) 方法發現NNK 所誘導的DNMTs 表現會結合至抑癌基因啟動子區域，進而造成抑癌基因啟動子有過度甲基化的情形。 在動物模式實驗中，以免疫組織染色分析NNK 處理及未處理的老鼠肺組織切片，發現NNK 處理後所產生肺腫瘤組織的DNMT1、DNMT3B、p-AKT 與不活化態的p-GSK3β(ser9)蛋白表現比較高，而βTrCP 蛋白則有下降表現的情形。 在臨床研究方面，我們以免疫組織染色分析(Immunohistochemistry)偵測109 位臨床肺癌病人DNA 甲基轉移酵素表現量，發現曾經吸煙但後來有戒煙病人的DNMT1 蛋白過度表現情形 (31.1%) 比持續吸煙病人的DNMT1 蛋白過度表現情形 (69.4%) 明顯來的低 (P 值=0.001)。 結論: 由以上細胞、臨床及動物模式實驗結果顯示，香菸中致癌物NNK 的確會誘導DNMTs 蛋白表現的增加；進一步由細胞實驗結果也知NNK 會透過AKT 訊息路徑削弱GSK3β/βTrCP 調控DNMT1 蛋白降解作用，進而使DNMT1 蛋白質穩定性增加；而這些NNK 所誘導的DNMTs 蛋白也會結合到抑癌基因的啟動子位置上，進而導致抑癌基因啟動子產生過度甲基化的情形，因此成為導致肺癌發生的原因之一。