Browsing by Author "郭亭君"

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建立高重組蛋白表達之酵母菌Pichia Pastoris系統
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2012-07-??) 郭亭君; 張瀞文; 李振綱; 李冠群; Ting-Chun Kuo; Jing-Wen Chang; Cheng-Kang Lee; Guan-Chun Lee
利用真核表現系統來製造生產重組蛋白質已被廣泛應用於醫藥、食品與化學工業等方面，嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris是目前最常被用來大量表達重組蛋白質的真核表達系統，但由於不同外源基因在P. pastoris中經常會有不同的重組蛋白質表達量，為了要建立一個能穩定且大量表達重組蛋白質的系統，有許多研究報告提出增加外源基因在P. pastoris表達量的方法。本研究採用操縱細胞整體轉錄作用（global transcription machinery engineering）的技術，以提升Candida rugosa重組脂肪酶在P. pastoris的表達量，藉由隨機突變P. pastoris的重要轉錄因子SPT15（一種TATA-binding protein），達到改變P. pastoris的轉錄體（transcriptome），進而影響Candida rugosa重組脂肪酶（lipase）的表達量。利用高通量（high-throughput）脂肪酶活性測定法，挑出具有高脂肪酶表達量的突變株。目前已從464個突變株當中，篩選出16個突變株其脂肪酶表達量高於野生型1.5倍以上，其中最高的一株表達量為野生型的2.3倍。此結果顯示操縱P. pastoris整體轉錄作用可以提升外源重組蛋白在P. pastoris的表達量。
建立高重組蛋白表達之酵母菌Pichia Pastoris系統
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2012-07-??) 郭亭君; 張瀞文; 李振綱; 李冠群; Ting-Chun Kuo; Jing-Wen Chang; Cheng-Kang Lee; Guan-Chun Lee
利用真核表現系統來製造生產重組蛋白質已被廣泛應用於醫藥、食品與化學工業等方面，嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris是目前最常被用來大量表達重組蛋白質的真核表達系統，但由於不同外源基因在P. pastoris中經常會有不同的重組蛋白質表達量，為了要建立一個能穩定且大量表達重組蛋白質的系統，有許多研究報告提出增加外源基因在P. pastoris表達量的方法。本研究採用操縱細胞整體轉錄作用（global transcription machinery engineering）的技術，以提升Candida rugosa重組脂肪酶在P. pastoris的表達量，藉由隨機突變P. pastoris的重要轉錄因子SPT15（一種TATA-binding protein），達到改變P. pastoris的轉錄體（transcriptome），進而影響Candida rugosa重組脂肪酶（lipase）的表達量。利用高通量（high-throughput）脂肪酶活性測定法，挑出具有高脂肪酶表達量的突變株。目前已從464個突變株當中，篩選出16個突變株其脂肪酶表達量高於野生型1.5倍以上，其中最高的一株表達量為野生型的2.3倍。此結果顯示操縱P. pastoris整體轉錄作用可以提升外源重組蛋白在P. pastoris的表達量。
重組Candida rugosa脂肪酶在Pichia pastoris的表達量提升及其在生產生質柴油的應用
(2015) 郭亭君; Ting-Chun Kuo
脂肪酶 (lipase) 在生物技術領域中，是一種極重要且具應用潛力的生物觸媒，已廣泛被應用於食品、醫藥、清潔劑、化學合成及油脂等工業。假絲酵母 (Candida rugosa) 脂肪酶具有廣效的受質特異性，是一種重要的工業用酵素，並已廣泛地被應用於生物技術領域中，該脂肪酶的組成包含了數種性質互異的同功酶 (isoenzymes)，先前的研究已將五種同功酶基因 (CRL1-5) 成功的在Pichia pastoris中表現具有活性的脂肪酶，並且證明了此五種同功酶的催化性質皆不相同。然而，在 Pichia 系統表達的脂肪酶產量尚未符合經濟效益，因此本研究選擇以CRL2 為研究目標，針對 Pichia 表達系統的轉錄、轉譯與全基因體層面設計了四個提升產量的策略，期望能提升蛋白的產量。(1) 在轉錄層面，首先我們藉由依序提高抗生素的濃度來增加LIP2 基因套數。當抗生素 Zeocin 濃度由 100 g/mL 提高至 500 g/mL，在 105 個轉型株當中，我們篩選到三個活性相較於其母株提升 2.4-5.8倍的菌株，結合低溫培養的策略，可再提升脂肪酶表達量至 32 倍，此方法可應用在提升其他四種同功酶在 Pichia 系統的產量；(2) 在轉錄層面，我們另一方面藉由隨機突變 Pichia 的 GAP 啟動子，建立一個突變庫以篩選較強的啟動子。在此策略下，我們構築一個雙同源互換的質體，利用抗生素為報導基因，成功建立啟動子篩選平台；(3) 在轉譯層面，我們希望藉由分泌蛋白胜肽 (-factor）的 mRNA 結構最適化，欲藉此提升轉譯的初始效率。透過隨機突變 -factor 的核甘酸序列但不改變氨基酸序列的情形下，我們由 1,500個突變株當中，篩選到兩個脂肪酶活性提升 1.2 倍的菌株，並且證實了突變株的5’ mRNA 結構的鍵結能量較野生株低；(4) 在全基因體層面，我們利用global transcription machinery engineering (gTME) 方法隨機突變 P. pastoris 的轉錄因子 TATA-binding protein，希望藉此改變全基因轉錄體，刺激細胞性狀改變，最後我們由 1,300個突變株當中，篩選到三個脂肪酶活性相較於野生株提升 1.5 倍的菌株。在重組CRL2的應用方面，目前尚未有利用市售 C. rugosa 脂肪酶針對非食用性油脂進行轉酯化，成功生產生質柴油的報導。本實驗利用 P. pastoris 表達的四個重組同功酶 (CRL1-CRL4)，針對非食用油進行轉酯化生產生質柴油的研究。結果顯示 CRL2 及 CRL4 對於痲瘋樹籽油轉酯化生產脂肪酸甲酯 (FAME) 有較好的催化效果。CRL2 於最適反應條件下 (50 wt% 水，初始添加1當量甲醇，24小時再追加 0.5 當量甲醇，於 37oC 下總共反應 48 小時) 可達到最大 FAME 產量 95.3%。此結果可證實 C. rugosa 單一種同功酶可當作轉化低價的痲瘋樹籽油為生質柴油的良好生物觸媒。