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LRRK2、GRN基因變異與台灣帕金森氏症、額顳葉型失智症的相關性研究
(2008) 許玄竺; Hsuan-Chu Hsu
帕金森氏症(PD)為僅次於阿茲海默氏症常見的神經退化性疾病。臨床症狀包括四肢及軀體顫抖、行動緩慢等現象，主要的病理特徵是多巴胺神經元在基底核與其他腦幹神經核有退化死亡的現象，尤其以黑質之緻密區與路易氏體(Lewy body)存在的神經元最為嚴重。LRRK2基因為目前引起顯性遺傳帕金森氏症病患重要的基因。近年來研究發現LRRK2基因上的G2385R與R1628P變異為亞洲人種所特有的危險因子。本研究經定序PD患者的LRRK2 cDNA，找到一個已報導的R1441H、兩個未被報導過的R767H與S885N突變，及5個改變胺基酸、8個未改變胺基酸的多型性或變異。進一步針對R1398H、G2385R與M2397T多型性，進行病例-對照組研究，發現G2385R多型性異型合子在PD患者的頻率要高於正常人(8.4 vs. 4.2%, odds ratio = 2.08, 95% CI: 1.05-4.41, P = 0.044)，且M2397T多型性同基因型會加重G2385R異基因型對PD的感受性(4.2 vs. 0.4%, odds ratio = 10.63, 95% CI: 2.08-194.26, P = 0.024)。由於近年研究發現GRN基因突變與額顳葉型失智症(FTD)相關，本研究亦針對41位病人的GRN基因做定序分析，發現兩個未被報導的突變L57M、T487I及兩個已被報導的多型性D128、3’ UTR C>T。本研究結果可提供臨床上診斷及諮詢的參考。
Nrf2與神經退化性疾病：啟動子多型性與以氧化壓力為目標的治療策略
(2012) 巫逸琦; Yi-Ci Wu
Nuclear factor-erythroid 2 (NF-E2)-related factor 2 (Nrf2)是basic leucine zipper (bZIP)的轉錄因子，可調節抗氧化路徑基因的活化，並維持細胞內氧化還原的平衡。氧化壓力的增加與許多神經性退化性疾病有相關性。舉例來說，帕金森氏症(PD)的致病機制就會受到氧化壓力的影響，增強Nrf2的活化會對於神經細胞有保護性的功效。在polyQ不正常擴增的脊髓小腦萎縮症中，擴增的CAG三核苷酸轉譯出的polyQ蛋白，聚集在細胞內增加細胞內的氧化壓力。本論文先以PCR-RFLP技術，對Nrf2基因啟動子-653 A/G、-651 G/A和-617 C/A多型性，進行帕金森氏症患者(n = 480)與年齡、性別配合的正常人(n = 526)的病例-對照組研究。結果多型性基因型、等位基因頻率、單套型等均並未發現相關性。另外，本研究建立誘導式ATXN3/Q14~75的Flp-In SH-SY5Y細胞株，添加retinoic acid誘導分化後，表現具有病理特徵的ATXN3/Q75融合蛋白會形成聚集，並伴隨神經纖維生長減緩。藉高通量影像分析及免疫轉漬分析，此細胞株處理中草藥NH004、NH008、NH021及NH008某組成份衍生物NH008-1可活化Nrf2的表現，並降低ATXN3/Q75融合蛋白的聚集，故可能發展為有潛能的治療策略。
Parkin 基因內含子9 g>a 多型性的功能性分析
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2010-12-??) 張菀玲; 吳春嫺; 王慈蔚; 李桂楨; Wan-Ling Zhang; Chun-Hsien Wu; Tsu-Wei Wang; Guey-Jen Lee-Chen
帕金森氏症(Parkinson’s disease，簡稱PD)為中腦黑質細胞退化導致多巴胺分泌不足所引發的漸進性神經性退化疾病。現今研究尚無法明確指出PD 的病理機制，只知PD 與環境及多種遺傳因子相關。先前本實驗室對台灣部分發病年齡低於50 歲的PD 病患進行Parkin 基因突變篩檢，發現一新穎的內含子9 插入突變c.1084intron+，此插入突變與內含子9 的-6g>a 的多型性點相關。進一步PD 病例-對照組分析結果顯示-6a 等位基因顯著和高PD 感受性相關(Wu et al., 2010)。本研究選殖Parkin 全長cDNA，並於末端in-frame 接上綠螢光蛋白後，再於表現子9、10 間依序插入包含內含子9 裁接donor 序列、-6g>a 多型性序列及內含子9 裁接acceptor 序列。將此Parkin cDNA 裁接質體轉染入人類腦癌細胞SK-N-SH 後，利用西方轉漬及活細胞影像儀，分析Parkin-綠螢光融合蛋白的表現量。結果顯示帶有-6a 多型性的內含子9 裁接質體，裁接效率低於帶有-6g 的內含子9 裁接質體。故推論內含子9 的-6g>a 多型性可能因提高c.1084intron+插入突變發生的機率，而與PD的感受性相關。本研究結果或能提供臨床診斷諮詢的參考。
Parkin 基因內含子9 g>a 多型性的功能性分析
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2010-12-??) 張菀玲; 吳春嫺; 王慈蔚; 李桂楨; Wan-Ling Zhang; Chun-Hsien Wu; Tsu-Wei Wang; Guey-Jen Lee-Chen
帕金森氏症(Parkinson’s disease，簡稱PD)為中腦黑質細胞退化導致多巴胺分泌不足所引發的漸進性神經性退化疾病。現今研究尚無法明確指出PD 的病理機制，只知PD 與環境及多種遺傳因子相關。先前本實驗室對台灣部分發病年齡低於50 歲的PD 病患進行Parkin 基因突變篩檢，發現一新穎的內含子9 插入突變c.1084intron+，此插入突變與內含子9 的-6g>a 的多型性點相關。進一步PD 病例-對照組分析結果顯示-6a 等位基因顯著和高PD 感受性相關(Wu et al., 2010)。本研究選殖Parkin 全長cDNA，並於末端in-frame 接上綠螢光蛋白後，再於表現子9、10 間依序插入包含內含子9 裁接donor 序列、-6g>a 多型性序列及內含子9 裁接acceptor 序列。將此Parkin cDNA 裁接質體轉染入人類腦癌細胞SK-N-SH 後，利用西方轉漬及活細胞影像儀，分析Parkin-綠螢光融合蛋白的表現量。結果顯示帶有-6a 多型性的內含子9 裁接質體，裁接效率低於帶有-6g 的內含子9 裁接質體。故推論內含子9 的-6g>a 多型性可能因提高c.1084intron+插入突變發生的機率，而與PD的感受性相關。本研究結果或能提供臨床診斷諮詢的參考。
Parkin 基因內含子9 g>a 多型性的功能性分析
(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2010-12-??) 張菀玲; 吳春嫺; 王慈蔚; 李桂楨; Wan-Ling Zhang; Chun-Hsien Wu; Tsu-Wei Wang; Guey-Jen Lee-Chen
帕金森氏症(Parkinson’s disease，簡稱PD)為中腦黑質細胞退化導致多巴胺分泌不足所引發的漸進性神經性退化疾病。現今研究尚無法明確指出PD 的病理機制，只知PD 與環境及多種遺傳因子相關。先前本實驗室對台灣部分發病年齡低於50 歲的PD 病患進行Parkin 基因突變篩檢，發現一新穎的內含子9 插入突變c.1084intron+，此插入突變與內含子9 的-6g>a 的多型性點相關。進一步PD 病例-對照組分析結果顯示-6a 等位基因顯著和高PD 感受性相關(Wu et al., 2010)。本研究選殖Parkin 全長cDNA，並於末端in-frame 接上綠螢光蛋白後，再於表現子9、10 間依序插入包含內含子9 裁接donor 序列、-6g>a 多型性序列及內含子9 裁接acceptor 序列。將此Parkin cDNA 裁接質體轉染入人類腦癌細胞SK-N-SH 後，利用西方轉漬及活細胞影像儀，分析Parkin-綠螢光融合蛋白的表現量。結果顯示帶有-6a 多型性的內含子9 裁接質體，裁接效率低於帶有-6g 的內含子9 裁接質體。故推論內含子9 的-6g>a 多型性可能因提高c.1084intron+插入突變發生的機率，而與PD的感受性相關。本研究結果或能提供臨床診斷諮詢的參考。
PPP2R2B：外遺傳研究暨藥物篩檢模式的建立
(2011) 王允麟; Yun-Lin Wang
Protein phosphatase 2A (簡稱PP2A)是細胞內重要的蛋白去磷酸化酵素，其次單元B調控PP2A在細胞內作用的位置及催化的受質種類。PPP2R2B是表現在腦神經細胞中的PP2A調控次單元B。腦部表現的PP2A調節tau蛋白的磷酸化。Tau蛋白過度磷酸化和PP2A活性下降，皆和阿茲海默氏症(AD)相關。本實驗室的研究亦發現PPP2R2B的低啟動子活性，和國人的阿茲海默氏症顯著相關。本研究第一部份是以PPP2R2B啟動子接上EGFP報導基因，來建立人類胚胎腎HEK-293及神經腫瘤SK-N-SH細胞，轉染入轉錄因子SP1及CREB1後，分析綠螢光量變化，並未呈現預期的調控情形。第二部分為探討PPP2R2B DNA甲基化的外遺傳調控，與阿茲海默氏症的相關性。選取五組年齡及性別配對的病人及正常人DNA樣品，經Bisulfite定序，結果發現AD病人的PPP2R2B的5'端甲基化程度有高於正常人的趨勢，尤其是-311及-310的位置，雖然並沒有到達顯著差異。進一步的神經(SK-N-SH、SH-SY5Y)及非神經(HEK-293)腫瘤細胞PPP2R2B啟動子定序，顯示HEK-293細胞PPP2R2B啟動子上的甲基化，但以去甲基化藥物5-aza-dC處理HEK-293後，PPP2R2B表現量並未顯著上升，MeCP2的抗體的染色質免疫沈澱亦未看到MeCP2蛋白結合到PPP2R2B啟動子上。
PPP2R2B基因與臺灣失智症患者的遺傳及外遺傳研究
(2008) 李昇翰; Shen-Hung Lee
PPP2R2B (Bβ) 為廣泛表現在腦部的去磷酸酶 PP2A 的調控次單位。PPP2R2B 基因啟動子的差異使用及選擇性裁接，產生 Bβ1 及Bβ2 兩種異構型。Bβ1 異構型基因 5' 端的 CAG 重複擴增會使 Bβ1 的表現量增加，而導致第十二型脊髓小腦運動失調症。反之，本實驗室先前研究成果顯示，罕見短的 (CAG)5~7 等位基因和低轉錄活性及阿茲海默氏症相關。此外，外遺傳調控及功能性單一鹼基多型性等因子亦可能影響 Bβ1 的表現量。為檢視 Bβ1 基因 5' 端的外遺傳變化，我們以阿茲海默氏症病患及正常人的血液或淋巴細胞株 DNA 為材料，利用限制酶為基礎的甲基化試驗及 bisulfite 定序，來評估 CpG 島的甲基化程度，並利用染色質沉澱-聚合酶鏈鎖反應試驗，來評估染色質結構。結果發現阿茲海默氏症患者的 DNA 甲基化程度及組蛋白 dimethyl H3-K9 比值的增加，顯示外遺傳的變化可能改變阿茲海默氏症患者的 Bβ1 基因表現。在阿茲海默氏症與正常人族群的病例-對照組分析方面，我們檢測了 6 個 Bβ1 異構型基因啟動子上的單一鹼基多型性，與阿茲海默氏症、血管性失智症感受性的相關性。結果發現各多型性基因型、等位基因或單套型在患者與正常人族群間沒有顯著差異。最後本論文延續先前研究，擴大 Bβ1 異構型基因 CAG 三核苷酸重複的遺傳資料庫。雖然並未發現擴增的等位基因，但於二位舞蹈症患者中，觀察到罕見短的 (CAG)4 與 (CAG)6 等位基因，顯示此低轉錄活性的罕見短的等位基因可能與國人的舞蹈症相關。
PPP2R2B基因遺傳檢測,啟動子記述與單一鹼基多型性分析
(2007) 劉若芸; Ju-yun Liu
PPP2R2B基因轉譯出一個專一表現在腦部的去磷酸酶PP2A的調控次單位Bβ。當PPP2R2B基因5’端CAG三核苷酸不正常擴增時，會造成第十二型脊髓小腦運動失調症(SCA12)，但當抑制PP2A活性時，會使動物腦部Tau蛋白過度磷酸化，出現類阿茲海默氏症的症狀。先前本實驗室研究顯示，PPP2R2B基因上游-870 ~ +23序列可調節基因基礎表現，且台灣阿茲海默氏症患者中PPP2R2B基因5’端啟動子活性較低的(CAG)7等位基因頻率較正常人族群為高(2.8% vs. 0.2%)。本論文延續先前研究，首先擴大正常人及神經性疾病患者PPP2R2B基因CAG三核苷重複的遺傳資料庫，未發現任何擴增的等位基因，但在4位原發性顫抖症(2.0%)及1位舞蹈症(1.1%)患者，觀察到短的(CAG)5~7等位基因。其次分析PPP2R2B基因4 kb啟動子片段上4個單一鹼基多型性與阿茲海默氏症、原發性顫抖症感受性的相關性，各多型性基因型或等位基因在患者與正常人族群間沒有顯著差異，但-3170C/-2923A/-1905T/-428G單套型可能與阿茲海默氏症的感受性相關。在HEK-293、IMR-32細胞中，-4070 ~ +23的遠端啟動子的轉錄活性顯著低於-870 ~ +23近端啟動子，在SK-N-SH、HEK-293、IMR-32細胞中，(CAG)5~7的近端啟動子轉錄活性亦顯著低於(CAG)16者。
TNF-α及IL-1α基因啟動子多型性與台灣帕金森氏症感受性的分子遺傳學研究
(2006) 馮宜欣; I-Hsin Feng
帕金森氏症(Parkinson's disease； PD)是常見的漸行性神經退化性症病之一，其臨床病症主要表現於運動失調上，患者中腦黑質的緻密區(substantia nigra pars compacta)會有多巴胺神經元死亡的現象，部分檢體的神經元突起處或是細胞核周圍會出現嗜伊紅性的細胞質內蛋白質包涵體，包含環境毒素、氧化壓力、細胞發炎反應、遺傳因素等都是可能造成PD發病的原因本研究主要在著重在tumor necrosis factor-α (TNF-α)啟動子T-1031C、C-863A、C-857T、G-308A及interleukin-1α (IL-1α)啟動子C-889T多型性與PD易感受性的相關研究。在遺傳層面上發現T-1031C、C-857T在PD病患與控制組間有顯著的差異(P = 0.0062及0.0035)，但只有-1031CC基因型與PD的易感受性有關(Odds ratio: 2.96，95% CI: 1.38-7.09，P=0.0085)。利用SNPSpD分析發現-1031與-863有強力聯鎖情形(D'=0.93，Δ2=0.80)，且-1031C/-863A的單套型也與PD的易感受性有關(Odds ratio=2.18，95% CI: 1.33-3.69，P=0.0028)。在基因功能性層面上的研究發現Raji細胞中-1031C會有較高的轉錄活性，-308A則有偏低的活性，使用ConA處理可誘發-1031C更高轉錄活性的表現，淋巴細胞株的研究則顯示帶有-1031CC/-863AA基因型其TNF-α mRNA表現量有些微增加的現象。 IL-1α啟動子的研究上發現C-889T多型性在整體PD病患及控制組間並無顯著差異，但以發病年齡做區分可發現具-889 CT基因型的人其老年罹患PD的危險性會有顯著下降的情形(Odds ratio=0.31，95% CI: 0.13-0.71，P=0.0071)，且TNF-α -1031T、-863C、-857C對偶基因對-889 CT基因型有顯著的加成效應。總結本研究發現無論在基因層面上TNF-α啟動子-1031CC的基因型具有較高罹患PD的危險性，且因強力聯鎖緣故，所以-1031C/-863A的單套型也具有較高罹患PD的危險性。功能性的研究也證實在Raji細胞系統中-1031C帶有較高的轉錄活性，ConA的處理則可增加-1031C高轉錄活性的效應。IL-1α -889 CT的基因型在大於70歲發病的PD族群中與控制組間有顯著的差異，顯示具有CT基因型的人老年時會有較低罹患PD的危險性，且TNF-α啟動子常見的多型性對偶基因對CT基因型有顯著的加成效果，其組合也會減少老年時罹患PD的危險性
人類遺傳疾病：第一部份：台灣帕金森氏症的分子遺傳研究；第二部份：台灣杭丁頓氏症患者IT15基因CAG重複序列的單套型分析
(2005) 王政光; Cheng-Kuang Wang
第一部份：摘要帕金森氏症(Parkinson's disease；以下簡稱為PD)為一種好發於老年的神經退化性疾病，臨床上病人會出現休息性的震顫、僵直、緩動症和步伐不穩等運動功能失常症狀。病理學上PD病患的中腦黑質緻密區多巴胺神經元細胞本體及突起處出現嗜伊紅性的蛋白質包涵體稱為Lewy body，造成多巴胺神經元大量的死亡。包涵體內蛋白組成以-synuclein為主。-synuclein為一突觸前蛋白(presynaptic protein)由染色體4q21-23的SNCA基因所編碼（enode）。先前細胞及動物模式研究顯示，A53T及A30P突變的-synuclein蛋白容易堆積在包涵體內，顯示-synuclein蛋白質的變異可能參與PD的分子機制。近來亦有報導顯示SNCA基因的triplication及duplication與家族性PD相關，顯示野生型-synuclein的過度表現亦可能引發PD。除SNCA基因的突變外，parkin、DJ-1、UCHL1、PINK1、LRRK2等基因的突變亦被報導可能參與的PD致病機轉。但上述基因突變僅見於少數家族性PD患者，大部分偶發性PD的發生，可能和多種候選基因的多型性變異相關。本研究即針對SNCA、parkin、HSP70等候選基因的多型性變異，進行病例-對照組(case-control)的研究，而統計後具有顯著差異的基因變異，再配合功能性的檢測，以確認這些基因變異參與PD的致病分子機制。在SNCA基因之NACP-Rep1微衛星序列，NACP-Rep1微衛星基因型或對偶基因頻率，在患者與正常人族群間沒有統計上的顯著差異，但RsaI T>C多型性的分析中，PD病患族群中C/C基因型和C對偶基因的頻率明顯要少於控制組(P值分別為0.0153、0.0135)。若以NACP-Rep1和RsaI T>C進行單套型分析，發現0-T及0-C單套型在PD和控制者族群間的分佈存在顯著差異性(0-T：29.6% v.s. 22.6%，P=0.0287；0-C：6.9% v.s. 12.1%，P=0.0082)。另外，0-T單套型明顯地增加罹患PD的危險(odds ratio為1.54；95% CI 1.11-2.15，P = 0.0103)；相反地，0-C單套型卻降低此種風險(odds ratio為0.57；95% CI 0.36-0.90，P = 0.0177)。利用同步定量PCR檢測在PD患者血液中白血球SNCA mRNA的表現量，發現RsaI T/T和RsaI T/C基因型者確實有差異(但不顯著)，進一步構築報導質體分析此多型性對轉錄活性的影響，結果無論是IMR32細胞或293細胞，RsaI-C對偶基因明顯驅動較低的報導基因轉錄活性。在HSP70基因家族的多型性分析顯示，HSP70-2和HSP70-hom的多型性的基因型分佈在PD患者和正常人之間並無顯著差異。然而，HSP70-1 -110 A>C、+190 G>C兩多型性的基因型分佈在PD患者和正常人之間有顯著的差異(P = 0.0004、0.012)，其中-110 C/C和+190 C/C基因型在PD患者族群的比率明顯高於正常族群(P = 0.001、0.006)，而無論是-110 C/C或+190 C/C基因型其罹患PD的相對風險明顯增高(-110 C/C者odds ratio為2.91，95% CI 1.51-5.96，P = 0.0002；+190 C/C者odds ratio為3.59，95% CI=1.53-9.88，P = 0.006)。利用報導基因分析啟動子的多型性，發現-110 A對偶基因無論在IMR32細胞或是293細胞中均能驅動較高報導基因的轉錄能力，而且在細胞經熱休克處理後也呈現相似的趨勢。在parkin基因的分析上，利用SSCP和定序篩檢126個PD患者的parkin基因的所有表現子，結果僅一個位於表現子中的異型合子的突變被發現(P437A)。而分析三個位於表現子的多型性S167N、R366W、Vl380L後，發現這三個多型性無論是在基因型的分佈或對偶基因的頻率均無顯著的差異，因而推測這三個基因多型性並不影響對台灣地區個體對PD的感受性。綜言之，本研究結果顯示SNCA基因RsaI T>C取代和HSP70-1的-110 A>C可能影響台灣地區個體對偶發性PD的感受性，而parkin基因的變異則較不相關。第二部分：摘要杭丁頓氏症(Huntington's disease；簡稱HD)是一種體染色體顯性的神經退化性疾病，肇因於染色體4p16.3位置的IT15基因中，CAG三核苷重複序列擴增。其臨床症狀包括中年發病、運動、認知及精神性的失調。IT15基因轉錄出huntingtin蛋白，CAG擴增會導致此蛋白的多麩醯胺片段(polyglutamine tract)增長而致病。正常人CAG的重複序列範圍在10 ~ 34個，而病患的CAG重複序列則會擴增到35個以上；範圍在36 ~ 39者則有不完全穿透(incomplete penetrance)的現象。統計顯示隨著擴增的範圍增大，病患發病的年齡也會提早。IT15基因擴增多發生於由父親傳給子代，而導致子代發病提早及症狀更為嚴重，稱為預期現象(anticipation)。鄰近CAG重複片段3'端處，另有一多型性的CCG三核苷重複序列。研究顯示西方的族群HD對偶基因和(CCG)7的多型性有高度的連鎖，而日本族群則和(CCG)10高度連鎖。本研究在分析53個HD患者及172名無親緣關係的正常個體後，發現HD對偶基因CAG重複序列的範圍從38到109，而正常族群的CAG重複序列範圍則是10 ~ 29。另外，在利用多重線性回歸分析發病年齡和CAG重複序列的範圍呈現逆相關性，但鄰近的CCG重複序列對發病年齡的影響並不顯著。利用CCG和兩個鄰近的雙核苷酸重複標記D4S127、D4S412進行單套型的分析，結果顯示三個標記中的兩個與HD基因呈現連鎖不平衡，而單套型分析24個HD家族的個體，發現HD對偶基因有三個主要的單套型佔所有HD染色體的87.5%。這些資料顯示，在台灣地區出現的多種HD單套型顯示疾病的發生可能來自於一次或更多的突變事件所導致。
以amyloid-β 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略
(2013) 黃鉦翔; Chen-Hsiang Huang
阿茲海默氏症是最常見的老年癡呆症，主要臨床症狀包括Aβ胜肽聚集而成的細胞外澱粉樣蛋白斑與tau蛋白形成的細胞內神經纖維糾結。Aβ胜肽與tau蛋白的聚集往往是基於β-結構互相堆疊而形成。由於藉由破壞蛋白之間的氫鍵可能抑制蛋白聚集，故可能可以從吲哚、多酚類及其衍生物和中藥材篩選出潛在的Aβ胜肽聚集抑制劑。為了達成以上目的，本實驗利用thioflavin T分析法篩選人工合成之化合物。此外，於細胞層面上將Aβ42胜肽與GFP螢光蛋白的N端融合，用於反映Aβ42聚集之程度，並建立於SH-SY5Y細胞和293細胞中，篩選出Tet-On SH-SY5Y細胞與Tet-On 293細胞。Tet-On 293細胞被用來測試植物萃取物與天然或人工合成化合物，藉由綠色螢光訊號區別可延緩或抑制Aβ42聚集之抑制劑。本實驗使用Tet-On 293阿茲海默氏症細胞模式於高通量分析系統，並結合自動顯微鏡與圖像分析自動測試化合物的有效濃度。本實驗分析出10種植物萃取物與人工合成化合物，能提升Aβ42-GFP綠螢光之訊號，其中NTNU-043、NTNU-057、NTNU-059、NTNU-071、NC009-1以及NC009-2等較具潛力，能增加Hsp27蛋白表現，幫助抑制Aβ42聚集。
以chaperone、proteasome為目標的多麩醯胺小腦萎縮症治療策略
(2013) 龔品睿; Pin-Jui Kung
在多麩醯胺居間的疾病中，轉譯CAG三核苷酸重複的擴增造成各自的蛋白中包含一長的多麩醯胺鏈，在神經細胞之細胞核和細胞質中形成聚集。熱休克蛋白可防止蛋白錯誤摺疊及聚集。泛素蛋白酶體系統的活化亦會幫助不正常摺疊蛋白的降解。本研究目標在建立細胞系統，用來鑑定可增強熱休克蛋白/蛋白酶體功能的化合物/中草藥，來治療多麩醯胺疾病。利用螢光報告基因的細胞檢測，本研究發現NH014-1及NC001-8化合物可增強HSF1、HSPA8和HSPA1A表現，NH005和NH006中草藥可增強蛋白酶體功能。另外，本研究建立誘導表現SCA17 TBP/Q36~79的Flp-In SH-SY5Y細胞株，螢光顯微鏡檢視及Metamorph軟體分析顯示，retinoic acid誘導分化後，表現的TBP/Q79蛋白形成聚集，並伴隨神經纖維生長減緩(包含突出、分支數)。化合物/中草藥處理表現TBP/Q79及誘導神經分化的SH-SY5Y細胞後，聚集抑制的情形顯示NC001-8、NH005、NH006為有潛能治療策略。
以tau 聚集為目標的阿茲海默氏症治療策略
(2013) 陳炫江; Hsuan-Chiang Chen
阿茲海默氏症是一種漸近性的神經退化性疾病，主要病理特徵包括細胞外間質的Aβ 胜肽堆積，及細胞內高度磷酸化tau 形成的神經纖維糾結。由於tau 聚集與阿茲海默氏症進程具相關性，因此透過抑制或消除tau 聚集或可保護受影響之神經細胞。本研究構築tau 蛋白微管結合重複區域(tauRD)之野生型(K18)及第280 位置賴胺酸缺失的促tau 聚集突變型(ΔK280)與DsRed 紅螢光蛋白融合之tauRD-DsRed基因，來建立誘導表現tauRD-DsRed 之Tet-On 293 與Tet-On SH-SY5Y 細胞，作為藥物篩檢平台，來篩檢可抑制tauRD 聚集的抑制物，並對這些具聚集抑制性的化合物或中草藥、植物萃取物等，檢測其神經保護機制。在Tet-On 293 細胞誘導tauRD-DsRed 蛋白表現後，ΔK280 突變型細胞螢光亮度較野生型細胞顯著減少。以剛果紅(正控制組)處理細胞後，突變型細胞的紅螢光亮度較野生型者更能有效提升。對於 293 促tau 聚集突變型細胞，在細胞數無顯著影響下，前處理 NC009-1、-2、-3、-6、-7 (吲哚基喹啉化合物)、NTNU-003、-008 (GSK-3β抑制劑類似物)、NH021、NTNU-043、-057、-059、-224、NTNU-309、 -313、-319、-331、-379 (中草藥或植物萃取液)等皆可顯著提升DsRed 紅螢光亮度。以維他命A 酸誘導ΔK280 促tau 聚集突變型SH-SY5Y 細胞神經分化後，螢光顯微影像分析顯示神經突觸生長性狀(包含總生長及突起數、分支數)較野生型K18 細胞顯著下降。以NC009-1、 -7 及NTNU-008 前處理突變型SH-SY5Y 細胞後，可顯著提升神經突觸總生長性狀，並可提升HSP27 蛋白(NC009-1、-7)或GRP 78、HSP27 蛋白(NTNU-008)的表現。
以微矩陣比較基因體雜合方法偵測東西方肺癌族群新穎致癌基因及其機制與臨床探討
(2011) 羅芳宜; Fang-Yi Lo
　　近年研究顯示，腫瘤形成基因於不同種族之間存在差異性。因此，鑑別各人種族群之間共通及具有差異性的基因群，是近代研究腫瘤形成的重要課題。為了進一步探究腫瘤形成相關基因的分子機制，本研究收集了40 對來自於臺灣肺癌病人（由台北榮民總醫院胸腔外科許瀚水醫師提供檢體）及20 對來自於美國白種肺癌病人（由美國芝加哥大學附設醫院胸腔外科Dr. Ravi Salgia 醫師提供檢體）的東西方肺癌族群樣本，對其進行微矩陣比較基因體(array-comparative genomic hybridization, array-CGH) 的圖譜分析。本研究發現，於東方肺癌群族偵測到17 段染色體變異區域，涵蓋註解基因數為476；並於西方肺癌群族偵測到20 段染色體變異區域，涵蓋註解基因數為 459。進一步針對本研究室先前分析出的expression array 基因群進行一致性比對，篩選214 個於肺癌族群中基因結構變異及基因表現異常趨勢相符的候選基因，並對候選基因進行基因已知功能的資料庫搜尋。這些候選基因包含位於6p22.1 參與MAPK 路徑的 ZNF322A 基因、位於10q24.1 參與Rho GTPase 路徑的 ARHGAP19 基因、位於 10q24.1 參與Wnt 路徑的 FRAT2 基因、以及位於17p13.3 功能與 motility 相關的 PAFAH1B1 基因。本研究對這四個極具潛力的候選基因進行即時定量聚合酶鏈鎖反應系統、chromogenic in situ hybridization 方法、反轉錄即時定量聚合酶鏈鎖反應系統及免疫組織染色法，確認候選候選基因於臨床肺癌樣本及肺癌細胞株中的基因變異情形，其結果顯示候選候選基因其基因體套數及其 mRNA 表現量皆於肺癌組織中高於正常組織 (P<0.001~P=0.06)。本研究亦利用反轉錄即時定量聚合酶鏈鎖反應及免疫組織染色法對101 位肺癌族群檢測 PAFAH1B1 基因其 mRNA 及蛋白層次變異情形。結果發現 PAFAH1B1 基因於 mRNA 層次的過度表現頻率為62.4%，於蛋白層次過度表現頻率為57.4%，且此基因於mRNA 及蛋白層次的過度表現皆與病人的晚期具有相關性 (mRNA：P=0.008，蛋白層：P=0.008)，且屬於腺細胞癌 (P=0.020) 及男性 (P=0.049) 的病人於蛋白層次的過度表現具有較差的預後，顯示PAFAH1B1 基因於肺癌族群具有過度表達的變異；細胞及動物實驗顯示過度表達PAFAH1B1 且可能促進肺癌細胞轉移能力。本研究提供了第一個東西方肺癌族群新穎基因變異資料庫，並以細胞、動物及臨床模式探討基因變異之致癌機轉。
以肺癌細胞株與動物模式探討新穎的吲哚結構合成化合物1,1,3-tri(3-indolyl)cyclohexane抑制腫瘤細胞生長機制
(2008) 李慶孝; Ching-Hsiao Lee
目的：肺癌在世界各地無論男性或女性都是發病率、死亡率名列前茅的惡性腫瘤。因此，發現與合成新穎的肺癌治療抗癌藥物是刻不容緩的工作。材料與方法：本研究發展了一種新穎的吲哚結構合成化合物1,1,3-tri(3-indolyl)cyclohexane (3-indole)，設計使用二步法合成，該技術方法縮短製備過程，產品質量和產量也獲得提高，並藉由人類肺癌細胞株 (A549, H1299, H1435, CL1-1, and H1437) 來探討新穎抗癌藥物對於肺癌細胞的毒殺作用及其機制，同時進行前臨床動物實驗測試。結果：新穎的抗癌藥物3-indole經由不同濃度處理，可以誘導人類肺癌細胞株 (A549, H1299, H1435, CL1-1, and H1437) 進行細胞週期休止 (cell cycle arrest) 及細胞凋亡 (apoptosis)。細胞週期研究初步實驗結果顯示調控細胞週期休止的蛋白p53與p21表現增加，顯示p53/p21相關訊息傳遞路徑重要性。目前已知有兩個機轉可以調控細胞凋亡現象，第一個作用機轉是經由caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) 相關性機轉活化而引起細胞凋亡，目前已被認定有粒線體參與訊息傳遞的內在路徑與細胞外死亡訊息接受器作用的外在路徑；第二個機轉是經由caspases非相關性機轉。西方墨點法實驗結果顯示，調控細胞凋亡進行的促進凋亡蛋白Bax、Bad表現增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表現下降，而粒線體細胞色素C釋放至細胞質情形也有增加，另外一方面，透過caspases活性分析實驗結果顯示，3-indole主要是藉由caspases-9、caspases-3參與粒線體訊息傳遞的內在路徑以誘發細胞凋亡發生。此外，3-indole誘導A549人類肺癌細胞株粒線體膜電位下降、活性氧分子 (reactive oxygen species, ROSs) 產量增加，與細胞生長調節相關MAPK (Mitogen-activated protein kinase) 家族分子c-Jun N端蛋白質激酶 (JNK) 表現增加，同時顯示有DNA損傷情形。進一步活性氧分子抑制劑實驗結果顯示，JNK表現與DNA損傷可部分減少。3-indole誘導細胞凋亡情形受到活性氧分子抑制劑或JNK訊息抑制劑阻斷，顯示活性氧分子與JNK壓力相關訊息傳遞路徑重要性。此外，初步實驗結果，其他生長調節相關訊息傳遞蛋白 (如Akt與p38/COX-2) 表現也受到3-indole抑制，顯示PI3K/Akt與p38/COX-2訊息傳遞路徑重要性。同時前臨床動物實驗測試結果顯示3-indole抑制A549及H1435肺癌細胞株生長。結論：3-indole在細胞模式與動物模式呈現具有抑制肺癌細胞株生長的作用，其誘導細胞死亡是透過ROS與JNK路徑之粒線體訊息傳遞的內在細胞凋亡，同時可誘導細胞週期休止以及抑制肺癌細胞株Akt與p38/COX-2的表現，顯示使用二步法合成，具有高質量和產量的3-indole具有發展作為新穎的抗癌症用藥的價值。
促發炎細胞激素啟動子多型性與台灣帕金森氏症感受性的相關性研究
(2006) 劉瑾妮; Chin-Ni Liu
帕金森氏症(PD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病。目前的相關研究認為帕金森式症成因可能是多種因素共同交互影響產生的結果，包括遺傳因素、環境因素及神經性發炎都可能影響帕金森氏症的發病進程。本研究分析台灣帕金森氏症患族群及正常人族群的IL-1β、IL-6和IL-8基因啟動子區域上的單一核苷酸位點之多型性(single nucleotide polymorphism; SNP)變異，比較正常人與帕金森氏症患者的IL-1β C-511T、IL-6 G-174C和IL-8 T-251A啟動子多型性的差異，以及其不同的基因型與帕金森患者開始發病年齡(age- at-onset)、性別的相關性分析，但並未發現此三種細胞激素與PD發病有相關性。另外選取帶有特定TNF-α -1031基因型(TT或CC)之帕金森患者的淋巴細胞株，以內毒素Lipopolysaccharide (LPS)誘發細胞發炎反應後，藉RT-PCR與同步定量PCR實驗方法，分析TNF-α mRNA表現量，發現各淋巴細胞株對於TNF-α的感受性也有差異。若以cytokine protein array的技術，在促使細胞發炎情況下檢視多種細胞激素的表現量，則發現PD病患之淋巴細胞株經LPS處理後，較正常人之淋巴細胞株釋放出更多的 thrombpoietin、EGF及TNF-β。
台灣人族群阿茲海默氏症及血管型失智症的生物標記評估
(2009) 王秀觀; Hsiu-Kuan Wang
阿茲海默症與血管型失智症是最普遍的兩類失智症。目前有關阿茲海默症的疾病診斷生物標記分子研究中，已知的遺傳標記分子有脂蛋白E基因4對偶基因、類澱粉蛋白前驅蛋白基因突變、早老素1及早老素2基因突變等。腦部及腦脊髓液中tau蛋白與類澱粉蛋白含量則為已確認的阿茲海默症疾病診斷蛋白標記分子。本研究利用台灣阿茲海默症、血管型失智症與正常人族群基因分型技術，分析候選基因多型性變異與疾病的相關性。結果發現脂蛋白E基因4對偶基因是阿茲海默症、而非血管型失智症的風險因子；血管收縮素轉換酶基因DD基因型、D對偶基因和-240 T – Alu D單套型是阿茲海默症與血管型失智症的風險因子；此外，實驗結果顯示介白素1基因-889 CT基因型對於70歲以上的血管型失智症罹病感受方面具有潛在的保護功能；同時，熱休克A5基因-415 AA/-180 GG基因型、-415 A/-180 G對偶基因會減低罹患阿茲海默症的風險。基因表現分析結果亦顯示，具有-415 A/-180 G對偶基因的細胞在遭受內質網壓力之後，其熱休克A5蛋白被誘發產生的程度明顯增加。由於尋找阿茲海默症淋巴細胞的生物標記的可行性，本論文亦分析了8個阿茲海默症及4個年齡、性別配合之正常人的APP蛋白型式及氧化蛋白，但未找到明顯的蛋白標記。以上實驗結果顯示，上述與阿茲海默症及/或血管型失智症的罹病相關的基因，可作為協助疾病診斷的遺傳標記分子。
台灣族群帕金森氏症FBXO7 基因變異的分子遺傳及功能研究
(2015) 黃奕澂; Huang Yi Chang
帕金森氏症主要為中腦黑質緻密區的多巴胺神經細胞缺失所引起的神經退化性疾病。FBXO7基因位於染色體22號q12-q13上，與家族性早發性帕金森氏症和錐狀體病症有相關。FBXO7蛋白由522個胺基酸組成，N端帶有ubiquitin-like fold、C端帶有F-box domain，為ubiquitin E3 ligase complex內的重要因子。本研究探討FBXO7基因變異與台灣族群帕金森氏症的相關性。首先針對家族性及早發性84位帕金森氏症病人進行FBXO7 cDNA定序分析，結果共發現二個兩個多型性點Y52C (c.155A>G)、I115M (c.345A>G)。進一步對所蒐集的帕金森氏症病人(516位)與性別、年齡相當的正常人(516位)進行Y52C、I115M的病例-對照組分析，結果顯示Y52C多型性G等位基因頻率在病人族群中明顯較正常人族群低，且和低帕金森氏症感受性相關(0.4% vs. 1.2%, P = 0.046)。進一步結合中國大陸數據(Luo et al., 2010)，651位病人與716位正常人的病例-對照組分析結果亦顯示低帕金森氏症感受性(0.5% vs. 1.4%, P = 0.012)及低罹病機率(odds ratio: 0.33, 95% confidence interval: 0.12-0.77, P = 0.017)。目前已建構EGFP標記及V5-His和pcDNA5/FRT/TO的FBXO7 cDNA質體，表現於SH-SY5Y及HEK-293T細胞，進行次細胞分層、西方轉漬、螢光顯微鏡分析、蛋白穩定性、蛋白質體功能分析和神經纖維分析。本實驗希望可提供疾病診斷及遺傳諮詢的文獻。關鍵字: 帕金森氏症、神經退化性疾病、FBXO7 基因、多型性點Y52C
台灣族群帕金森氏症Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) 基因變異的分子功能研究
(2011) 張文騰; Wen-Teng Chang
PARK8基因座的LRRK2 (全名leucine-rich repeat kinase 2)基因，其突變會導致體染色體顯性的帕金森氏症。LRRK2蛋白具有多個功能區域，於神經系統、大部份器官及淋巴細胞等都有表現。新穎的R767H、S885N變異及已報導過的R1441H變異，是本實驗室在臺灣帕金森氏症患者發現的突變點，R1628P和G2385R兩變異則是華人帕金森氏症的危險因子。本論文首先建構EGFP標記的野生型及R1441H、R1628P、G2385R變異的LRRK2質體(含S1647T、M2397T多型性)，送到HEK-293T細胞中表現，經共軛焦顯微鏡觀察、西方轉漬分析研究，顯示上述變異對LRRK2蛋白在細胞內的位置及合成皆無受到影響。其次選殖α-synuclein cDNA，與R767H、S885N、R1441H、G2019S (白種人常見，作為對照)突變的LRRK2質體共轉染入SK-N-SH細胞，經細胞免疫螢光染色及共軛焦顯微鏡觀察，顯示野生型LRRK2廣泛分佈在細胞質並與α-synuclein有些微連繫。突變的R767H、S885N、R1441H、G2019S亦主要分佈在細胞質，R1441H和G2019S的LRRK2容易形成不含α-synuclein且鄰近細胞核的聚集。進一步的表現上述LRRK2質體於HEK-293T細胞二至六天後，螢光顯微鏡觀察及定量統計結果顯示R1441H和G2019S較野生型的LRRK2顯著地容易誘導更多的包涵體。最後，選殖V5標記的ARHGEF7 cDNA，並建構不含S1647T、M2397T多型性的Myc-His標記的LRRK2質體，共轉染入HEK-293T細胞，進行免疫共沉澱與GTP結合能力試驗的分析，結果發現S885N、R1441H、G2019S等突變影響LRRK2蛋白與ARHGEF7的交互作用。
台灣族群帕金森氏症Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2)基因變異的分子遺傳及功能研究
(2012) 江佩茹; Pei-Ru Jiang
　　LRRK2基因，全名為leucine-rich repeat kinase 2 (轉譯出LRRK2蛋白，又稱震顫素)，是目前引起體染色體顯性遺傳的帕金森氏症的重要基因。LRRK2蛋白在體內各處皆有表現，包括中央神經系統、主要器官及淋巴球等。先前我們針對早發型帕金森氏症患者進行LRRK2 cDNA定序，找到兩個未被報導過的R767H與S885N突變，及六個改變胺基酸的多型性。本研究進一步探究LRRK2與台灣帕金森氏症的相關性。結果於21位早發性PD患者的cDNA定序發現一個未改變胺基酸的變異N2047 T>C。PCR-RFLP檢測PD患者的已知突變亦新發現一S885N突變。帕金森氏症患者的病例-對照組研究結果顯示，G2385R的GA基因型及A等位基因與帕金森氏症顯著相關。另外，本研究亦建構EGFP及Myc-His標記的野生型及R767H、S885N突變型的LRRK2質體，送到HEK-293T細胞中表現，西方轉漬分析、螢光顯微鏡觀察、活細胞影像儀觀察結果顯示，野生型LRRK2-EGFP融合蛋白主要分佈在細胞質，且與粒線體及內質網等胞器位置重疊，突變型的LRRK2蛋白在細胞中的表現情況與野生型相似，並無明顯差異。