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利用酵素工程技術提升海藻糖合成酶的酵素轉化效率
(2012) 曾信豪; Hsin -Hao Tseng
海藻糖 (trehalose) 存在於許多生物體當中，除了作為能量的儲存形式之外，在脫水等逆境時穩定蛋白質和生物膜的結構，保護細胞免於環境壓力。在食品、化妝、醫藥業上都有廣泛的應用。海藻糖合成酶 (trehalose synthase，TS) 為可逆催化麥芽糖分子內鍵結轉化成海藻糖的酵素，屬於一種麥芽糖異構酶，同時，TS 亦有水解麥芽糖產生葡萄糖的副反應，為海藻糖的生合成路徑之一。本研究在提升 TS 的轉化效率，並以Deinococcus radiodurans trehalose synthase (DrTS) 為研究對象，利用已知結構之 SI (sucrose isomerase) 為模板模擬出 DrTS 立體三級結構。結構顯示，DrTS 的整體結構與一般的 α-amylase 的結構相似，在中央擁有一個催化的區域，由 (β/α)8 的桶狀結構所組成，以及一個富有 loop 的子區域和兩個反向平行的 β-sheet 區域。藉由將麥芽糖偶合來模擬 DrTS 與受質結合的立體結構，發現距離麥芽糖 5 Å 的周圍有 21 個胺基酸會與受質結合。從 DrTS與 SI 的胺基酸序列與立體結構的比對，發現這 21 個胺基酸當中有 9 個是不相同的，推測這 9 個胺基酸可能造成 DrTS 與 SI 功能上有差異的原因，再與其他 TS 的胺基酸比對後，發現這 9 個不同的胺基酸中，有 3 個胺基酸不同於其他 TS，分別為 Thr154、Phe174 和 Gln254。推測這 3 個胺基酸位置可能是決定不同的 TS 具有不同生化性質或轉化率的原因，本研究利用定點飽和突變與高效率純化暨活性篩選系統針此 3 個胺基酸進行突變，篩選出高海藻糖轉化率突變種，其中在 Thr154 突變庫當中，挑選出兩株活性大於野生型三倍者，經 DNA 定序顯示其 Thr154皆被取代為 Phe。此外，Asn317 被預測可能與參與水解反應的水分子結合，而在 316 位置 DrTS 具有一種與其他 SI 明顯不保守的胺基酸 Arg，推測可能也會影響與水分子的結合，以及 Asn253 被預測可能藉由阻礙活性中心的開口處保護中間產物，避免水分子進入催化中心造成水解。為了減少水解的副反應，因此將親水性的 Asn317 藉由定位突變取代成疏水性的 Phe、Leu 或 Ala，並將帶正電的 Arg316 藉由定位突變取代成不帶電性的 Gly，結果顯示 Asn317 突變成 Phe、Leu 或 Ala 以及 Arg316 突變成 Gly 雖然會使水解副反應減少，然而卻會造成酵素活性降低。將 Asn253 藉由定位突變取代成芳香族的 Phe，結果顯示 Asn253 突變成Phe 會使水解副反應與酵素活性完全喪失。此外利用另兩種策略來改善 DrTS 轉化率。一種是偶合葡萄糖異構酶 (Glucose isomerase，GI)，將 TS 反應副產物葡萄糖轉化成果糖，來減少副產物的抑制效果，結果顯示偶合 GI 能提升 DrTS 在高溫的海藻糖轉化率約 4%。另一種方法是抑制 TS 的逆反應，藉由加入 α-葡萄糖苷酶抑制劑 (validoxylamine A、validamycin A、kanamycin A、acarbose 或 azactidine) 或是海藻糖的類似物 (lactose、lactulose 或 isomaltulose)。結果 kanamycin A 抑制逆反應比抑制正反應多 5% ，validoxylamine A、validamycin A 或 acarbose 對正逆反應的抑制程度相近，然而 azactidine、lactose、lactulose或 isomaltulose 對 DrTS 的正逆反應沒有影響。以上結果可以提供從事 TS 之蛋白質工程的參考。