學位論文
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Item 利用雙甲基化搭配液相層析串聯式質譜技術進行蛋白質藥物Trastuzumab之雙硫鍵結鑑定分析(2011) 謝育廷雙硫鍵在穩定蛋白質的三級結構和維持其生化活性上扮演重要的角色,同時,雙硫鍵的完整鍵結與否,常常關係到蛋白質藥物的品質.傳統上利用質譜分析蛋白質雙硫鍵的方法,常採用間接鑑定方式,比較經過還原前和還原以後含有cysteine胜肽質譜圖的差異,雙硫鍵的兩個胺基酸cysteine經還原後會接上兩個氫,而使該胜肽鏈的分子量多2 Da,但當同一個蛋白質裡含有複雜且多條的雙硫鍵時,就會產生更多樣的排列組合,所以這樣的方法,並不適用於分析具有多條複雜雙硫鍵的蛋白質. 在本篇研究中,我們提出一套鑑定雙硫鍵的方法,應用於蛋白質藥物trastuzumab上.在非還原的條件下,利用雙甲基化胜肽在Q/TOF質譜中,CID碎片會有a1離子訊號被提升的現象,搭配計算軟體RADAR掃描a1離子及其對應分子量,並與資料庫中含有cysteine的胜肽組合去比對,藉此鑑定出雙硫鍵的位置.此外,將針對不同的蛋白酶搭配,多種蛋白質水解與雙甲基化的最佳條件作測試,以期可以在最短的時間內,鑑定到最多正確的雙硫鍵數目.最後,在最佳化實驗條件下,利用RADAR對a1離子作自動化的掃描,成功的鑑定出trastuzumab上七條雙硫鍵位置. 本篇研究提供一套快速且正確鑑定雙硫鍵的方法,適用於例行的蛋白質藥物結構的鑑定,可以發展成一套完整有效的蛋白藥物品管方式.Item 利用質譜技術鑑定甲型流感病毒血球凝集素H7蛋白的雙硫鍵鍵結(2019) 葉沛柔; Yeh, Pei-Jou雙硫鍵為影響蛋白質功能與活性的關鍵結構因子，對於可作為疫苗的重組抗原蛋白來說，雙硫鍵會影響其摺疊以及結構，錯接的雙硫鍵會嚴重的影響抗原與抗體結合的特異性，因此蛋白質正確雙硫鍵鍵結的鑑定是極重要的。本篇研究中，我們利用雙甲基化反應搭配液相層析質譜技術以及RADAR軟體的輔助，鑑定甲型流感病毒H7N9病毒顆粒以及其重組的血球凝集素H7蛋白： H7蛋白三聚體、H7蛋白單體以及Dsbc-H7、Dsbc-HA1。蛋白質樣品利用不同的酵素組合在酸性環境下水解，在本研究中使用包含: 胰蛋白酶 (trypsin)、trypsin + chymotrypsin、trypsin + asp-n等組合。使用trypsin + asp-n的酵素組合可在全部的樣品中鑑定到四個雙硫鍵鍵結，此為鑑定H7蛋白最佳的酵素組合。雙硫鍵片段C272-C296可在H7N9樣品中被鑑定到，而雙硫鍵片段C4-C458則在H7-trimer中被鑑定到。此雙硫鍵分析方法可對於蛋白質活性提供重要的資訊，據我們所知，此篇為首次利用雙硫鍵分析的方法探討甲型流感病毒H7N9血球凝集素H7重組蛋白活性的研究。Item 以質譜技術評估在不同酸鹼值環境水解Avastin之雙硫鍵錯接變化(2015) 張瓊文; Chang, Chiung-Wen正確的雙硫鍵摺疊影響蛋白質的活性及結構穩定性，因此對蛋白質類藥物而言，鑑定雙硫鍵的連接情況至關重要。隨著質譜技術的成熟，現今多以生化質譜方法鑑定蛋白質雙硫鍵，在此方法中需使用酵素水解蛋白質。酵素活性範圍多為弱鹼性環境，然而在弱鹼性環境下可能使蛋白質雙硫鍵還原再重新摺疊形成不同構型的雙硫鍵，造成在結構鑑定上無法判斷是樣品本身的雙硫鍵摺疊錯誤還是因實驗過程而產生的雙硫鍵重組。在本研究中，以溶菌酶（Lysozyme）及Bevacizumab（Avastin）作為樣品，控制酵素在中性以及弱酸性的溶液下進行水解，再使用雙甲基化標記結合質譜方法搭配RADAR軟體鑑定雙硫鍵，進而觀察雙硫鍵連接情形的變化，以提供最佳化鑑定雙硫鍵的實驗條件，降低雙硫鍵重組應造成的干擾。以trypsin及Lys-C在pH 6環境水解樣品，可完整鑑定到預期的含雙硫鍵胜肽，且皆未鑑定到錯接雙硫鍵。而以trypsin + Glu-C搭配變性劑rapigest在pH 6環境下水解Avastin，也可完整鑑定到預期的含雙硫鍵胜肽，且未觀察到錯接雙硫鍵。以thermolysin進行水解，不論在pH 5, 6, 7環境下都有觀察到錯接雙硫鍵的存在。本研究結果顯示，選用適當的酵素、在弱酸性的環境下進行水解反應，可有效的減少雙硫鍵重組反應的發生，雖然使用的酵素活性受到抑制，但依舊可以成功鑑定到溶菌酶及Bevacizumab中所有的雙硫鍵。