學位論文
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Item 基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法和拉曼光譜技術於茜素媒染色澱成分鑑定及結構解析之研究(2024) 王彥淳; Wang, Yan-Chun本研究使用基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜法和拉曼光譜技術，探討茜素與媒染劑（包括醋酸鋁，硫酸鋁鉀，醋酸鋁與醋酸鐵）反應時，形成「茜素-金屬離子」有機金屬錯合物的可能結構。此反應一旦形成有機金屬錯合物，其沉澱物的顏色分佈為紅色到褐色。該沉澱物可使用基質輔助雷射脫附飛行時間型質譜儀加以測量，並以CHCA (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid)作為基質。實驗結果發現在正電模式時，質譜圖上有一明顯的訊號在m/z=504.043，符合兩個茜素分子與醋酸鋁中的鋁離子錯合的荷質比。此外在測量茜素與明礬溶液的訊號時，還偵測到了茜素與鋁離子和鉀離子的中間產物之訊號在m/z=316.049、m/z=331.069、m/z=375.075、m/z=392.082，符合茜素分子與鋁離子和鉀離子錯合時配位了羥基和甲氧基的荷質比。利用拉曼光譜觀察到特徵峰值分別為1298 cm-1、1332 cm-1、1454 cm-1、1480 cm-1代表了C-OH和C-H的彎曲振動，以及C-C的伸縮振動，還觀察到了1630 cm-1 的C=O伸縮振動和1162 cm-1及1193 cm-1的 C-H彎曲振動和C-C的伸縮振動，基於這些特徵峰值最後推測出化學結構，並比對文獻參考進行驗證。為了探討媒染後的顏色變化，利用LabVIEW程式中RGB數值轉換為波長的程式，探討該方法取代反射式吸收光譜法的可行性。Item 免疫沉澱法搭配質譜技術對前列腺癌特異性抗原前體異構物定量分析以改善前列腺癌之偵測(2013) 段立平; Li Ping Tuan前列腺特異性抗原 (PSA) 是目前最成功且廣泛使用的前列腺癌 (PCa) 血清標誌物。但在重要診斷指標PSA濃度4~10 ng/mL的範圍內，它具有有限的能力在區分早期的前列腺癌與良性前列腺增生症 (BPH)，缺乏癌症特異性。近年來研究發現前列腺特異性抗原前體 (proPSA) 與前列腺癌更具相關性。ProPSA是血清游離PSA的特殊形式，由天然proPSA及其各種截斷的亞型組成，[-2] proPSA、[-5] proPSA及[-7] proPSA，而其各種截斷的亞型分子已被發現比天然proPSA與癌症有更好的相關性。(不是說不要分段嗎?)多反應監測質譜技術 (MRM-MS) 近年來頻繁地被應用於測量低含量的組織和生物體液中的生物標誌物，由於其高靈敏度和高特異性，實驗設計簡單和高度重複性。本研究建立一套利用免疫沉澱法搭配質譜多反應監測掃描技術之優化方法，檢測定量血清樣品中mature PSA、proPSA及truncated proPSA ([-5] proPSA)，藉此改善PSA對前列腺癌偵測之特異性。由於血清和血漿是目前最複雜的生物樣品，針對此，我們特別對免疫沉澱步驟當中所使用之實驗用管柱及緩衝溶液進行優化測試，以達到較高之純化效率，並且使用不同純化策略-免疫親和去除法¬比較純化目標蛋白質之效率。實驗結果證明此研究策略可有效純化血清中proPSA且定量檢測結果呈現良好之線性關係，proPSA及mature PSA的R2 >0.99，[-5] proPSA的R2 >0.99，偵測極限 (LOD) 和定量極限 (LOQ) 皆可達到proPSA濃度ng/mL的範圍內，對應血清中含量最高蛋白質的濃度，濃度低於6個數量級。此外，本研究策略在一次LC-MRM-MS實驗分析中可以檢測多個生物標誌物，包括成熟和前體形式的PSA。本研究開發此方法提供一個具吸引力的替代方案，藉由檢測定量血清樣品中proPSA及truncated proPSA以改善PSA對前列腺癌偵測之特異性。Item 利用雙甲基化標記搭配質譜儀技術自動化鑑定蛋白質雙硫鍵鍵結(2013) 陳群皓; Chun-Hao Chen驗證生物藥物的正確摺疊結構，以及正確雙硫鍵鍵結，越來越受到重視。正確蛋白質構型可維持蛋白質活性，而蛋白質後轉譯修飾所產生的雙硫鍵鍵結，主要扮演著維持蛋白質構型的角色。本研究中，利用雙甲基化標記以及質譜鑑定方法，搭配自製軟體RADAR自動化計算篩選a1離子的策略，將RADAR軟體應用於鑑定蛋白質藥物Bevacizumab與Trastuzumab的雙硫鍵鍵結，以及台南與新竹兩地區的複雜眼鏡蛇蛇毒蛋白的雙硫鍵鍵結。由於經雙甲基化標記胜肽後於MSMS質譜分析圖譜中，將產生a1離子訊號增強現象，藉此現象可鑑定其雙硫鍵鍵結胜肽的N端胺基酸殘基。RADAR軟體可自動化與數據庫中含半胱胺酸之胜肽進行比對，首先比對其a1離子，若符合N端胺基酸再比對其分子量，接著進一步比對其離子碎片，藉此策略快速鑑定雙硫鍵鍵結。應用RADAR軟體自動比對其a1離子策略，已成功鑑定出蛋白質藥物Bevacizumab與Trastuzumab所有的雙硫鍵鍵結。另外，於台南眼鏡蛇蛇毒蛋白上鑑定得到18個蛋白質的雙硫鍵鍵結；新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白上鑑定得到17個蛋白質的雙硫鍵鍵結。針對雙甲基化反應使用之還原劑氰基硼氫化鈉，探討還原劑濃度及反應時間是否會造成非預期雙硫鍵鍵結產生實驗中，證明還原劑氰基硼氫化鈉不影響非預期雙硫鍵鍵結產生。本研究主要提供一個簡單以及快速鑑定雙硫鍵鍵結的方法，不但可作為檢查蛋白質藥物結構品管工具，同時也適用於鑑定複雜蛋白質混合物的雙硫鍵鍵結。Item Item 固定化鐵離子親合層析質譜技術之蛋白質磷酸化研究(2005) 賴承煜; LAI CHEN-YU蛋白質磷酸化在細胞訊息傳遞及功能調控上扮演關鍵角色。雖然目前已發展數種鑑定蛋白質磷酸化的方法，但要觀察到細胞內所有的蛋白質的磷酸化仍有一段很長的距離。這是由於蛋白質的磷酸化是一個動態現象，在細胞內的含量低，並且位置也會有所不同。為了要解決這樣的困難，發展更有效的分析蛋白質磷酸化的方法仍是一個重要的課題。 在本論文中，我們結合次細胞分離法(subcellular fractionation),凝膠電泳（SDS-PAGE）,金屬親和層析 ( immobilized metal affinity chromatography,IMAC),質譜 (mass spectrometry, MS)等技術分析複雜蛋白質樣品中所含的磷酸化蛋白，並針對其中IMAC 對於磷酸化胜的容量，專一性，沖提體積以及條件作細部的探討以及最佳化。為了證明此分析平台的可用性，我們將其應用在分析Ｔ細胞中的磷酸蛋白上。實驗中在細胞質中在603 個蛋白質中發現了782 個磷酸化胜及891個磷酸化的位置，在所有鑑定出的胜中，磷酸化胜佔百分之九十。此平台能廣泛應用在分析大量蛋白質磷酸化的研究上。