學位論文
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Item 利用雙甲基化搭配液相層析串聯式質譜技術進行蛋白質藥物Trastuzumab之雙硫鍵結鑑定分析(2011) 謝育廷雙硫鍵在穩定蛋白質的三級結構和維持其生化活性上扮演重要的角色,同時,雙硫鍵的完整鍵結與否,常常關係到蛋白質藥物的品質.傳統上利用質譜分析蛋白質雙硫鍵的方法,常採用間接鑑定方式,比較經過還原前和還原以後含有cysteine胜肽質譜圖的差異,雙硫鍵的兩個胺基酸cysteine經還原後會接上兩個氫,而使該胜肽鏈的分子量多2 Da,但當同一個蛋白質裡含有複雜且多條的雙硫鍵時,就會產生更多樣的排列組合,所以這樣的方法,並不適用於分析具有多條複雜雙硫鍵的蛋白質. 在本篇研究中,我們提出一套鑑定雙硫鍵的方法,應用於蛋白質藥物trastuzumab上.在非還原的條件下,利用雙甲基化胜肽在Q/TOF質譜中,CID碎片會有a1離子訊號被提升的現象,搭配計算軟體RADAR掃描a1離子及其對應分子量,並與資料庫中含有cysteine的胜肽組合去比對,藉此鑑定出雙硫鍵的位置.此外,將針對不同的蛋白酶搭配,多種蛋白質水解與雙甲基化的最佳條件作測試,以期可以在最短的時間內,鑑定到最多正確的雙硫鍵數目.最後,在最佳化實驗條件下,利用RADAR對a1離子作自動化的掃描,成功的鑑定出trastuzumab上七條雙硫鍵位置. 本篇研究提供一套快速且正確鑑定雙硫鍵的方法,適用於例行的蛋白質藥物結構的鑑定,可以發展成一套完整有效的蛋白藥物品管方式.Item 利用雙甲基化標記搭配質譜儀技術自動化鑑定蛋白質雙硫鍵鍵結(2013) 陳群皓; Chun-Hao Chen驗證生物藥物的正確摺疊結構，以及正確雙硫鍵鍵結，越來越受到重視。正確蛋白質構型可維持蛋白質活性，而蛋白質後轉譯修飾所產生的雙硫鍵鍵結，主要扮演著維持蛋白質構型的角色。本研究中，利用雙甲基化標記以及質譜鑑定方法，搭配自製軟體RADAR自動化計算篩選a1離子的策略，將RADAR軟體應用於鑑定蛋白質藥物Bevacizumab與Trastuzumab的雙硫鍵鍵結，以及台南與新竹兩地區的複雜眼鏡蛇蛇毒蛋白的雙硫鍵鍵結。由於經雙甲基化標記胜肽後於MSMS質譜分析圖譜中，將產生a1離子訊號增強現象，藉此現象可鑑定其雙硫鍵鍵結胜肽的N端胺基酸殘基。RADAR軟體可自動化與數據庫中含半胱胺酸之胜肽進行比對，首先比對其a1離子，若符合N端胺基酸再比對其分子量，接著進一步比對其離子碎片，藉此策略快速鑑定雙硫鍵鍵結。應用RADAR軟體自動比對其a1離子策略，已成功鑑定出蛋白質藥物Bevacizumab與Trastuzumab所有的雙硫鍵鍵結。另外，於台南眼鏡蛇蛇毒蛋白上鑑定得到18個蛋白質的雙硫鍵鍵結；新竹眼鏡蛇蛇毒蛋白上鑑定得到17個蛋白質的雙硫鍵鍵結。針對雙甲基化反應使用之還原劑氰基硼氫化鈉，探討還原劑濃度及反應時間是否會造成非預期雙硫鍵鍵結產生實驗中，證明還原劑氰基硼氫化鈉不影響非預期雙硫鍵鍵結產生。本研究主要提供一個簡單以及快速鑑定雙硫鍵鍵結的方法，不但可作為檢查蛋白質藥物結構品管工具，同時也適用於鑑定複雜蛋白質混合物的雙硫鍵鍵結。