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    使用Aβ折疊報告細胞篩選靶向ERK及AMPK/EEF2K訊息的合成化合物作為新穎阿茲海默症治療策略
    (2023) 祁舜慈; Chi, Shun-Tzu
    阿茲海默症(Alzheimer’s disease, AD)是一種與年齡相關的神經退化性疾病，會逐漸的破壞記憶力以及學習能力，其主要病理特徵有大腦中β-澱粉樣蛋白(Aβ)堆積形成的斑塊，以及過度磷酸化tau蛋白所形成的神經纖維纏結。其中Aβ的堆積會損害神經元的突觸可塑性、增加細胞內的活性氧物質，並對神經元造成損害，因此開發AD藥物的其中一種方法，便是防止Aβ的堆積或阻斷Aβ寡聚體的神經毒性。研究有發現，在AD患者的CA1腦區中，編碼核糖體蛋白的基因受到異常的調節，其中與蛋白質的合成有關的真核延伸因子2 (Eukaryotic elongation factor 2, EEF2)在AD疾病中出現下調。EEF2在神經元的存活中起到重要的作用，可維持突觸可塑性。在真核細胞轉譯的過程中，EEF2的活性受到嚴格的控管。真核延伸因子2激酶(Eukaryotic elongation factor 2 kinase, EEF2K)藉磷酸化EEF2的T56位點抑制其活性，來調控轉譯的過程。EEF2K的活性受多種訊息路徑調控，如AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)及細胞外訊息調節激酶(Extracellular-signal regulated kinase, ERK)。AMPK的訊息傳導可透過磷酸化S398位點來活化EEF2K，促使EEF2磷酸化失活，從而減少蛋白質合成；而ERK可透過磷酸化S366位點來抑制EEF2K的活性，使EEF2去磷酸化活化，來促進蛋白質的合成，如：腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)。本論文利用Aβ折疊報導細胞Aβ-GFP SH-SY5Y細胞，探究吲哚衍生物(Indole derivatives: NC009-1, -3, -6, -11)及香豆素衍生物(Coumarin derivatives: LM-016, -021, -022, -036)，改善Aβ錯誤折疊的情形及神經保護作用。在八種測試的化合物中，除NC009-3外，所有化合物均符合Lipinski預測口服生物利用度的標準。根據計算出的極性表面積和血腦屏障滲透評分，八種化合物皆被預測為可滲透血腦屏障。所檢測的化合物皆可改善Aβ的錯誤折疊以及相關的氧化壓力。此外，前處理NC009-1、NC009-6及LM-021、LM-036可有效降低凋亡蛋白酶-3/6以及抑制乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)的活性，並促進神經突生長。接下來，為了解化合物促進細胞中蛋白質合成之作用機制，使用嘌呤酶素標定的轉譯的表面傳感(Surface sensing of translation, SUnSET)分析法，發現NC009-1、LM-021及LM-036的處理可增加細胞中新合成的蛋白質。此外，NC009-1增加了p-ERK (T202/Y204)和p-EEF2K (S366)的表達，LM-021降低了p-AMPK (T172)和p-EEF2K (S398)的表達，而LM-036同時作用於兩條途徑，增加EEF2K的S366磷酸化並減少S398磷酸化，從而導致EEF2K活性降低。隨後對應的p-EEF2 (T56)抑制活性的降低，增強了p-CREB (S133)及其下游BDNF、BCL2蛋白的表達，並促進神經突生長。研究結果可作為開發新穎且有潛能的阿茲海默症治療策略的參考。
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    中草藥及天然或合成化合物對阿茲海默氏症細胞與動物模式的治療效用
    (2018) 邱雅貞; Chiu, Ya-Jen
    阿茲海默氏症(AD)是有關漸進性認知衰退和記憶力喪失的疾病， 也是最常見的一種老人痴呆症，病理學上病徵之一是由 β-澱粉樣 (Aβ)沉積物組成的老年斑。研究發現，腦中的 Aβ 堆積會造成氧化壓 力和發炎損傷，進而導致神經細胞凋亡及認知功能失調。有鑑於 此，尋找可能減少 Aβ 聚集的方法，可能有效治療 AD。本研究檢視 中藥脹果甘草(G. inflata)及其活性成分甘草查爾酮 A (Licochalcone A)、甘草素(Liquiritigenin)，和本校化學系姚清發老師提供的合成化 合物 NC009-1，抑制 Aβ 聚集的情形及神經保護性。誘導性 Aβ-GFP 293 細胞、硫黃素 T (Thioflavin T)或 DPPH 清除自由基試驗結果顯 示，脹果甘草/活性成分和 NC009-1，皆可抑制 Aβ 蛋白聚集和相關 聯的氧化壓力。此外，LPS/IFN-γ 刺激發炎的小鼠 BV-2 微膠細胞試 驗顯示，脹果甘草/活性成分可減少 BV-2 的發炎反應，來達到抗發 炎的效果。另外，誘導性 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞試驗結果顯示，脹 果甘草/活性成分和 NC009-1 可抑制乙醯膽鹼酶(acetylcholinesterase) 活性、增強 SOD2 表現、及/或促進神經突生長。為瞭解脹果甘草/活 性成分和 NC009-1 對細胞保護的分子機制，以抗體或 PCR 矩陣，檢 測 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞中，與細胞凋亡相關蛋白或阿茲海默氏症 相關基因的表現。結果發現，脹果甘草/活性成分可減緩 BCL2 的下 降，並減低 IGFBP2 的上升、凋亡蛋白酶 3 的切割、BAD 及 BAX 的量，來保護 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞免於 BV-2 制約培養液誘導的 細胞死亡。然而 NC009-1 在 Aβ-GFP SH-SY5Y 細胞中，可正調控 APOE 和 TRKA 的表現。在鏈脲佐菌素(Streptozocin)誘導高血糖的 PS1M146V、APPSwe 和 TauP301L 三基因(3×Tg) AD 轉殖鼠的實驗中， NC009-1 並可挽救 APOE 和 TRKA 的減少，降低海馬迴及腦皮層中 Aβ 及 Tau 的量，及減緩認知缺失。這些研究結果指出，脹果甘草/ 活性成分與 NC009-1 可能作為 AD 的治療策略。
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    可延緩Aβ誘發神經不正常去極化之中草藥純物質
    (2015) 蔡涵容; Tsai, Han-Jung
    阿茲海默氏症是一種隨著時間漸漸惡化的重度失智症。目前對於造成阿茲海默氏症發病原因的假說是：因為神經細胞類澱粉前驅蛋白APP的不正常剪切修飾以及神經細胞內骨架蛋白tau的過度磷酸化，最終造成神經細胞壞死，進而使病患失智。有研究指出，β類澱粉蛋白所具有的神經毒性會影響大腦皮質神經元及海馬迴區域麩胺酸的訊息傳遞路徑，並破壞麩胺酸訊息傳遞所調控的學習以及記憶。神經訊息傳導物質麩胺酸自突觸前神經元大量釋出後，會與突觸後神經元細胞膜上的麩胺酸受器AMPA、NMDA、Kainate、mGluR1/3/5結合。為了抑制β類澱粉蛋白誘發的神經毒性，有一種NMDA受器的拮抗劑名為Memantine的藥物，已在臨床中使用於治療重症阿茲海默氏症患者。由於中草藥已被廣泛使用數千年，此研究想從中草藥篩選出能減緩β類澱粉蛋白所誘發的神經損害。實驗使用出生一到三天的小鼠，分離出其大腦神經元進行初級培養，使用免疫螢光染色法和西方墨點法檢驗如vGLUT1/2、AMPAR、PSD95、Type III tubulin這些特殊的標記來確認麩胺酸神經元的純度以及神經軸的形成。再者，使用感應膜電位變化的螢光染劑DiBAC4(3)來偵測神經細胞膜電位的變化。我們使用這個平台來篩選抑制β類澱粉蛋白誘導去極化的中草藥。從四十多種中草藥目前找到六種具有此特性的中草藥單方，其中兩種命名為P1031及1057，在分析主成分其中之純物質P1031-PN及P1057-CC做進一步作用機轉的探討，發現P1031-PN可抑制β類澱粉蛋白所誘發神經不正常的去極化，其作用機轉之一為透過抑制NMDA受器所誘發的去極化，更進一步探討此純物質作用的訊息傳遞機制後，將可能發展成為治療阿茲海默氏症的藥物。