學位論文
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Item 建立和分析過量表現PPP2R2B 基因Bβ1之細胞與基因轉殖小鼠(2008) 高郁涵小腦脊髓萎縮症十二型 (Spinocerebellar ataxia 12, SCA12)是一種自體顯性遺傳疾病，目前在歐洲人和印地安人有病例發生。臨床徵兆有講話困難、小腦與周邊神經的病變、衰退，並伴隨著震顫的出現。SCA12是在基因PPP2R2B基因5’端CAG擴增所造成，也是目前在各型SCA疾病中所僅知功能基因5’端未轉錄部分擴增造成之結果，PPP2R2B基因會轉譯出一個專一表現在腦部的去磷酸PP2A (protein phosphotase 2A)的調控次單位Bβ。PP2A主要由三個次單元組成的Ser/Thr phosphatase，其組成次單元分別為A (結構次單元)、B (調控次單元)、C (催化單元)，而B次單元可以調控PP2A的生理角色進而調控很多細胞的功能，包含細胞週期的調控、tau的磷酸化和細胞自殺。CAG擴增的致病長度為55~78，而9~28是屬於正常範圍，而CAG的擴增被認為可能會影響到去磷酸酶的活性，進而改變蛋白質的磷酸化程度，使得細胞的正常功能失調。因此我們建立過量表現Bβ1的誘導細胞株和基因轉殖小鼠去測試這個假設。在動物模式中，我們已經得到異型核子與同型核子的基因轉殖小鼠並進行Rota-rod、locomotor和HomeCageScan之行為測試。總結，過量表現PPP2R2B基因引起基因轉殖小鼠的小腦病變包含了Purkinje cell 與神經細胞的缺少和神經膠化現象發生。其中也發現有情緒上的改變進而影響小鼠的行為表現之現象。為了測試過量表現Bβ1對細胞的影響，我們透過西方點墨法（western blot analysis）、細胞存活率測試（MTT assay）和細胞型態觀察來鑑定這些誘導細胞株。在加入氧化壓力藥物之後，轉入過量表現Bβ1的細胞株存活率明顯低於控制組，顯示細胞會因氧化壓力而導致凋亡。根據我們的研究顯示，過量表現Bβ1在我們的動物與細胞模式中，確實會造成神經細胞的毒性，而進一步導致神經凋亡。Item 以小鼠及細胞模式探討ATXN8OS過量表現之影響(2008) 王薏婷; Yi-Ting Wang脊髓小腦萎縮症第八型是一種漸進性的神經退化疾病，其致病的原因是由於染色體13q21上的ATXN8OS (又稱作SCA8,或KLHL1AS)基因在3’端外顯子的CTG三核苷酸不正常擴增所造成。目前對於此疾病的詳細致病機轉尚未了解，早期相關文獻指出ATXN8OS基因並不具有轉譯蛋白的功能，而可能是以anti-sense RNA影響對應股的KLHL1基因表現功能；然而最近文獻指出ATXN8OS的反譯股ATXN8，或許會轉譯出polyQ蛋白質，而polyQ蛋白質也正是許多型脊髓小腦萎縮症的致病原因；另外，也有研究指出在ATXN8OS基因上CTG三核苷酸擴增區域前，可能具有IRES活性，而使得此三核苷酸擴增轉譯出polyL毒性蛋白質。為了更進一步去了解ATXN8OS致病的分子機制，我們因而建立了ATXN8OS的轉殖小鼠模式。利用原核胚顯微注射的方法，將人類ATXN8OS基因帶有正常範圍(22)及致病範圍(150)兩種CTG擴增的基因片段，並連接了綠螢光報導基因，藉由NSE啟動子表現在小鼠的神經系統，以進一步了解CTG擴增對於小鼠造成的影響。從實驗結果中，我們發現帶有致病CTG擴增的轉殖小鼠，在小腦中有神經受損及缺失的情況發生，此外藉由行為測試也觀察到小鼠的異常行為，我們同時也將相同的基因架構轉殖進大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株(PC12)，建立離體的模式，藉此平臺可快速觀測ATXN8OS過度表現會對於神經細胞所產生的影響；從實驗中我們也發現到帶有致病範圍CTG擴增的細胞，在低血清及神經生長因子的分化刺激下，比正常的細胞更容易死亡，且其神經分化的能力也較差，由這些研究結果，我們發現不管ATXN8OS過度表現在離體及活體內均造成神經傷害，這些結果將有利於在相關疾病的基因及藥物治療研究之應用。