生命科學專業學院—生命科學系
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本系學士班之教育目標為「培育優良之生物科教師及生命科學研究人才」雙軌並行。
因應少子化的衝擊，本系調整相關員額及教學資源之分配，在課程設計及學習活動上，特別注重學生基礎學識、研究能力和研究方法的訓練，使學生可依個人志趣作學習規劃，畢業後有更寬廣的出路。
本系碩、博士班之教育目標則以「培養生命科學研究人才」為主，並兼顧師資培育，故課程設計及學習活動以培養獨立研究能力為主要目標。
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Item 甲基轉移酵素在肺癌病人變異的臨床研究及分子機制以及其作為新穎標靶抗癌藥物之探討(2007) 林若凱; Ruo-Kai Lin抑癌基因的啟動子位置上若被過度甲基化，導致該基因的不表達，往往造成腫瘤的生成。負責將啟動子甲基化的酵素是甲基轉移酵素(DNA 5’-cytosine-methyltransferase, DNMT)，包括有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b；但其在肺癌病人或細胞模式中並未有完整之變異分子機制與臨床研究，且其在癌症病人及細胞常發生不正常活化的改變，故引發出在癌症的治療中將 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。本研究在所檢測的100位非小細胞肺癌病人發現，其DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA及protein在腫瘤組織比正常肺組織有顯著過度表達的情形，P值分別有0.002、0.034 及0.027；特別是在鱗狀上皮細胞癌 (squamous carcinoma, SQ) 的病人統計發現DNMT1的蛋白有過度表達的情形，P值達0.04。當這些病人同時過度表達DNMT1及DNMT3b時，則顯示與p16INK4a、RARβ及FHIT 抑癌基因啟動子過度甲基化有關，P值達0.006。在病人的腫瘤組織採組織染色質免疫沉澱分析 (tissue chromatin immunoprecipitation) 的確發現DNMT1及DNMT3b蛋白是結合在過度甲基化的p16INK4a、RARβ及FHIT 基因啟動子上。 為了檢查DNMTs過度表達的原因，於是在肺癌細胞株H1299（不含p53基因）送入DNMTs的一個可能的負調控蛋白Wild-type p53，來了解p53對DNMTs啟動子的影響。本研究採用營火蟲冷光啟動子活性分析，發現Wild-type p53可抑制DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子活性，且在H1299肺癌細胞株長期表達Wild-type p53時，發現內生性的DNMTs之mRNA與蛋白表現量有下降的情形。而突變的p53蛋白則有增加其啟動子活性的趨勢。在病人組織樣本裡發現，這些有過度表達DNMT1的病人的確有p53 基因突變的情形，P值達0.016。這些病人同時以免疫組織染色來偵測DNMT1另一個可能的負調控蛋白RB，發現有過度表達DNMT1的病人同時伴隨著RB蛋白表達過低，P值達0.014。本研究進一步在正常的肺組織中利用組織染色質免疫沉澱分析，檢測到Wild-type p53及RB蛋白可以結合在DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子上。DNMTs除了受轉錄的調控之外，此研究更發現DNMT1的過度表達的病人與吸煙有顯著的相關，P值達0.037。在正常肺細胞IMR-90及肺癌細胞H1299測試下發現，DNMT1、3a及3b的蛋白質表現量可受香煙致癌物4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)的誘導而使其上升；此外，利用組織染色質免疫沉澱分析，發現在NNK處理細胞之後相較於控制組，檢測到DNMT1及DNMT3b蛋白結合在p16INK4a、RARβ及FHIT的啟動子上的程度顯著增加，該啟動子也的確被檢測是呈現過度甲基化。因此我們推測肺癌病人DNMTs的過度表達的原因可分為兩類：一是分子層次中的p53及RB變異有關，因其失去了負調控DNMT轉錄的能力；另一則是與吸煙有關，因香菸致癌物會誘導DNMTs的蛋白質表現量上升。而過度表達的DNMTs則使抑癌基因過度甲基化，最後導致肺癌的發生。 由於癌細胞基因體普遍出現CpG島群的甲基化異常而使抑癌基因失去活性的現象，因此抑制形成CpG島群的甲基化的藥物正可以作為恢復抑癌基因的表現及活化癌細胞中抑制癌症的重要路徑的新穎標靶藥物。而Mithramycin A (簡稱MMA)是一個會與富含GC及CG 序列的DNA 結合之藥物，因此本研究檢測癌細胞在經過MMA的處理之後，是否會抑制CpG島群甲基化的情形。我們發現當以低劑量(10 nM)的MMA處理癌細胞14天後，會減少轉移抑癌基因SLIT2及TIMP3的CpG島群過度甲基化的情形，並進而使這個具有抑制癌細胞轉移的SLIT2及TIMP3重現基因表達。同時間藉由膜穿透 (transwell) 實驗我們也發現MMA可降低具有高轉移能力的癌細胞CL1-5的穿越及移動能力。為了暸解MMA的作用途徑，我們使用西方點漬法發現MMA會使DNMT1蛋白明顯下降，但是DNMT1的基因表現不受影響。使用分子模擬 (molecular modeling) 發現DNMT的催化位置可被MMA藥劑所鍵結。總結研究結果發現，MMA具有去DNA甲基化及抑制癌細胞轉移的潛力。而抑制的機轉可能藉由抑制DNMT酵素催化能力並降低癌細胞中DNMT1的蛋白表達量，進而導致抑制癌細胞轉移的基因啟動子去甲基化且重新恢復表達。 本研究為首篇在肺癌病人或細胞模式針對三種主要甲基轉移酵素DNMT1, DNMT3a, DNMT3b完整之變異分子機制與臨床研究，且在肺癌細胞以GC DNA結合之MMA驗證其抑制 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。Item 探討五種中藥單方處理非小細胞肺癌細胞株之效果(2011) 沈志謙; Chih-Chien, Shen替代性療法近來在許多疾病中因為療效良好而備受關注；其好處 為除了可以有效的治療疾病之外，相較之下，其所帶來的毒性或是副 作用可能低於傳統的治療方式。多年以來，肺癌即是許多國家癌症死 亡的首位，而本研究主要的目的就是想要探討傳統的中草藥配方是否 對於非小細胞肺癌細胞株A549, NCI-H460, NCI-H520 具有抑制其生 長或是存活的效果。我們對細胞分別用了五種不同的中草藥 (HC1-HC5)作處理，再探討這些藥物是透過甚麼樣的機制去減低細胞 生長的情形。我們發現在五種中草藥方內有兩種中草藥HC3以及HC4 對於減低非小細胞肺癌細胞株之存活率有顯著的影響，但相同的劑量 對於正常細胞株MRC5 則沒有太大的影響。另外我們也以流式細胞 儀以及西方墨點轉漬的實驗進一步的探討藥物處理對於細胞週期的 表現影響，我們發現在藥物處理後細胞族群較多停滯在G1 以及G2 的現象，分析調節細胞週期的蛋白質表現結果也符合流式細胞儀看到 的結果。除此之外，我們也發現了A549 側群細胞(具有類癌幹細胞的 特性)的比例在經過藥物處理後有顯著降低的趨勢，我們也分析了間 質-表皮轉換(MET)的相關蛋白以進一步的解釋癌幹細胞可能的變化 機制。另外我們也觀測到癌細胞的轉移能力因為藥物的處理而降低。 由我們的分析結果顯示這些藥物也許有潛力可以應用於肺癌治療。Item 以A549肺癌細胞株為模式篩選對非小細胞肺癌有治療潛力之中藥複方(2010) 王天駿; Tien-Chun Wang肺癌長期以來都是全世界致死率最高的癌症疾病。根據型態上和病理上的特徵分類之結果，絕大多數的肺癌病例屬於非小細胞肺癌。雖然現今已經發展出許多針對癌症的治療方法，卻依然沒有可以確實治癒癌症的方法。我們利用非小細胞肺癌細胞株A549為模式，篩檢十五種臨床上常用的中藥複方，期能找出能有效治療肺癌的替代性藥物。在細胞毒性的初步篩檢中，我們挑出三種可以有效抑制A549細胞生長卻不影響正常肺部組織細胞MRC5的中藥複方，分別是三號、五號及十四號藥方。在進一步的分析中發現，此三種複方的處理會造成A549細胞週期停滯進而抑制細胞的生長，但不會顯著地造成細胞死亡，同時我們也發現在經由三種複方的處理後，cyclin D3、cyclin B1、CDK4和CDK6這些細胞週期調控蛋白的表現，有顯著下降的現象，得到與細胞週期停滯現象一致之結果。此外，我們也發現三號及五號複方能有效地減少具有癌幹細胞特性的側群細胞(side population)的比率，而這個現象似乎與間葉表皮轉換(Mesenchymal to epithelial transition)的機制無關。我們也試著藉由檢測血管內皮新生因子A (VEGF-A)表現量去應證這些在中醫理論中具有活血化瘀效用的藥方是否對於癌症細胞分泌促血管增生因子的行為有調節的效用。本實驗的結果提供了分子生物學上的證據去解釋這些複方在臨床上可能的治病機轉以及中醫理論在分子生物學上的意義，更重要的是，我們發現三個中藥複方具有可以被用來抑制非小細胞肺癌細胞之潛力。Item Wnt/beta-catenin訊號傳遞路徑基因:ICAT及HBP1之分子變異及肺癌臨床相關性研究(2007) 林素芬研究背景: ICAT (inhibitor of b-catenin and TCF) 和HBP1 (HMG-box transcription factor 1) 抑癌基因分別位於染色體1p36.2和7q31的區域。ICAT和HBP1兩個蛋白質屬於Wnt/b-catenin訊號傳遞路徑的成員，經由拮抗b-catenin/TCF (T-cell factor) 複合體的共同活化作用而抑制Wnt/b-catenin訊號傳遞路徑的功能。因此，本研究假設若ICAT或HBP1有變異的情形發生，可能會造成Wnt/b-catenin訊號傳遞路徑的過度活化而導致腫瘤發生。材料與方法: 我們分析了95位非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 病人的ICAT和HBP1蛋白表現、mRNA表現及啟動子過度甲基化情形，並將變異結果和臨床病歷資料做相關的統計分析。我們使用免疫組織染色法 (immunohistochemistry, IHC)，觀察病人ICAT和HBP1蛋白，再以反轉錄-聚合酵素鏈反應 (Reverse-transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 分析組織細胞中ICAT和HBP1基因mRNA轉錄是否異常，續以聚合酵素鏈反應為基礎的甲基化分析 (methylation-specific PCR, MSP) 偵測ICAT和HBP1基因的啟動子過度甲基化頻率。結果: 本研究發現95位NSCLC病人中ICAT和HBP1蛋白低表達頻率分為別26% (25/95) 和31.6% (30/95)，ICAT和HBP1 mRNA低表達頻率分別為37.9% (36/95) 和33.7% (32/95)，而ICAT和HBP1基因啟動子甲基化頻率分別為36.8% (35/95) 和45.3% (43/95)；ICAT和HBP1蛋白質/mRNA、mRNA/啟動子甲基化、蛋白質/啟動子甲基化表現彼此間都呈現統計上的顯著相關性 (P<0.05)；我們也發現，原本有HBP1基因變異的肺癌細胞株在經過去甲基化藥物5’-aza-2’-deoxycytidine的處理之後，會使肺癌細胞株HBP1基因啟動子去甲基化與mRNA蛋白質表現量上升。另外，將ICAT和HBP1變異情形和臨床病理資料作統計相關性分析，結果發現，HBP1 mRNA低表達多發生在抽菸 (P=0.035) 及鱗狀上皮細胞肺癌病人 (P=0.021)。為了探討ICAT和HBP1變異是否會引發Wnt/-catenin訊號傳遞路徑的過度活化而導致其目標基因過度表現，因此本研究亦檢測了50位NSCLC病人之Wnt/-catenin目標基因 MMP7 (matrix metallopeptidase 7) 的表現與ICAT和HBP1蛋白失去活性的相關性，研究結果顯示-catenin過度表現同時MMP7 mRNA亦過度表現的病人之間達統計上相關性 (P=0.008)，這些病人中同時有HBP1蛋白失去活性的病例之間統計上亦達邊緣顯著相關 (P=0.069)。結論: 由本研究結果顯示，ICAT和HBP1發生變異，確實在肺癌形成過程中扮演一個重要的角色，其變異主要機制為啟動子過度甲基化。因為ICAT和HBP1變異會失去拮抗b-catenin/TCF複合物活化下游基因的能力，而導致細胞中b-catenin/TCF目標基因，如：MMP7過度表現，進一步導致肺腫瘤的發生或轉移。本研究亦為在癌症病人中首篇完整探討ICAT和HBP1蛋白表現、RNA表現、DNA啟動子過度甲基化的研究論文。Item 肺癌之基因體缺失及其與雙股斷裂修補基因多型性之相關性研究(2006) 謝豐任; Feng-Jen Hsieh研究背景：癌症的形成常常是由於腫瘤抑制基因 (tumor suppressor genes, TSGs) 不表現，或是致癌基因 (oncogenes) 過度活化所造成，因此利用分佈在基因體的微衛星序列 (microsatellite markers)，針對基因體進行異質性喪失 (loss of heterozygosity, LOH) 分析，可以協助我們尋找未知的腫瘤抑制基因。大部分的肺癌組織都有很高的對偶基因缺失頻率 (fractional allelic loss, FAL)，顯示肺癌組織的基因體經常發生DNA缺失，這可能意味著癌細胞的DNA雙股斷裂 (DNA double-strand break, DSB) 修補機制效率不佳，無法將DNA雙股斷裂做適當的修復。細胞中的DNA雙股斷裂修補機制有兩個，分別是同源染色體重組路徑 (homologous recombination pathway, HR) 和非同源染色體末端接合路徑 (non-homologous end-joining pathway, NHEJ)。過去許多研究發現，基因多型性的差異會在某種程度上影響基因的功能或效率，導致不同的疾病發生敏感性，因此我們推測DNA雙股斷裂修補基因的基因多型性可能會影響肺癌的發生風險。 目的與方法：在LOH分析中，本研究使用112個微衛星序列針對84個非小細胞肺癌 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 病人進行基因體缺失分析，並且定義最小缺失區域 (minimal deletion region, MDR)，以尋找和肺癌發生相關的腫瘤抑制基因。另外，我們針對NHEJ路徑中的四個基因：Ku70、Ku80、Ligase IV和XRCC4，進行單一核苷酸多型性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 分析，以瞭解基因型對於肺癌發生敏感性的影響，並分析這四個基因之間是否有交互作用 (joint effect)。 結果：肺腺癌 (adenocarcinoma, AD) 和鱗狀上皮肺癌 (squamous carcinoma, SQ) 的LOH頻率分別是48%和42%。我們還發現25個MDRs，平均長度是5.18 cM，在AD和SQ中，分別有12和13個MDRs。其中MDRA7p1 (D7S1818-D7S506, 7p12.1-7p12.3) 的缺失和AD有關，而MDRS9p1 (D9S2169-D9S286, 9p24.1-9p24.3) 的缺失則是和SQ及抽菸有關。在SNP分析部分，Ku70和Ku80的基因型分佈在肺癌病人及無癌症族群間沒有顯著的差異 (P>0.05, multivariate logistic regression model)；但是我們發現當個體在Ligase IV (G3539A, Thr9Ile) 帶有高風險基因型 (A/A and A/G) 時，其得肺癌的危險比會明顯的提高 (adjusted odds ratio, aOR=1.64, 95% confidence interval, 95% CI=1.03-2.62, adjusted P=0.038)。此外，當個體在XRCC4 (G275626A, splice-site) 帶有高風險基因型 (G/G) 時，也會有較高的肺癌發生風險 aOR=2.38, 95% CI=1.05-5.76, adjusted P=0.043)。我們還發現在Ku70和Ku80之間，以及Ligase IV和XRCC4都有交互作用的存在，這樣的交互作用會使該個體的肺癌發生風險提高為一般人的4.65倍 (95% CI=1.19-24.08, adjusted P=0.040) 和8.75倍 (95% CI=2.27-57.77, adjusted P=0.006)。 結論：LOH分析以及MDRs的定義，將有利於尋找和肺癌發生有關的基因。SNP的分析，則讓我們瞭解NHEJ基因的基因多型性以及基因之間的交互作用，確實會影響肺癌發生敏感性。Item 一、探討新穎Indolylquinoline衍生物誘導非小細胞肺癌細胞凋亡機制 二、鑑定具有清除肺癌幹細胞的藥物(2014) 巫佩岑; Pei-Tsen Wu一.過去研究利用MTT assay以非小細胞肺癌細胞 (non-small cell lung cancer, NSCLC) 為平台篩選了逾五百種小分子化合物，發現含有indole 及quinoline這兩種官能基的小分子化合物compound A，於低劑量下，會抑制A549及H460這兩株NSCLC細胞生長速率及抑制A549腫瘤生長，但對抑癌基因p53缺失的H1299細胞株則無影響，接著使用western blot, MTT及flow cytometry，證實此藥物會誘導表現野生型p53的細胞產生凋亡，但是p53缺失的H1299細胞對此藥物的敏感度較低，而且不會出現凋亡。本論文內容是繼續探討此藥物對NSCLC細胞的調控生長機制與p53基因型的相關性。實驗主要是將p53缺失的H1299，分別轉殖入p53 DNA-binding domain 位點突變的p53R267P以及野生型p53的細胞株，其次再使用MTT 實驗，發現以此藥物10 µM處理H1299轉殖野生型p53細胞48小時後的生長速率較轉殖p53R267P敏感度高35％，繼續使用propidium iodide及Annexin V進行實驗，證實轉殖野生型p53細胞生長率的降低，是細胞凋亡造成，但以此藥物10 µM處理H1299/p53R267P細胞48小時後，細胞凋亡數目比例較H1299/p53細胞降低39.2％，最後由western blot確認細胞凋亡與p53及其下游poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) 裂解及caspase-3活化的蛋白質相關。這些實驗結果證明此藥物對表現野生型p53的H1299/p53細胞有最佳的治療效果，且野生型p53功能在此藥物誘導的凋亡機制中扮演了重要角色。未來實驗中將持續探討compound A如何降低腫瘤細胞生長，實驗會以癌症類幹細胞為模式，持續研究抑制腫瘤生長及轉移的機制。 二.中草藥療法在近幾年被重視，因為以中草藥搭配放射療法能減低癌症病患副作用，提升體質。本實驗以可能具有較高轉移能力及抗藥性的肺癌類幹細胞為模式，研究中藥苦參 (Sophora flavescens) 、鴨膽子 (Brucea javanica)、夏枯草 (Prunella vulgaris) 及西藥teroxirone 如何抑制肺癌類幹細胞生長。本實驗觀察幹細胞表面標誌Nanog，確認肺癌類幹細胞平臺的建立，接續使用螢光顯微鏡觀察幹細胞在這些藥物處理下，H460, H1299/p53及A549肺癌類幹細胞會隨藥物濃度及時間增加，其數目及形狀明顯的變少及變小，表示具有抑制肺癌類幹細胞生長的潛力，最後再以western blot實驗確認teroxirone會誘導H460肺癌類幹細胞走向p53依賴的細胞凋亡路徑。於先前研究中已知夏枯草可降低肝癌細胞的轉移力，苦參及鴨膽子可抑制A549腫瘤生長，此外，低劑量的teroxirone可抑制肺癌細胞生長及誘導細胞凋亡，所以日後將持續以此類模式探討這些藥物是否能抑制肺癌類幹細胞生長以及降低轉移能力。Item 利用非小細胞肺癌細胞以及動物模式探討中草藥之治療潛力(2013) 韋會妤; Hui-Yu Wei非小細胞肺癌在肺癌中具有高發生率與致死率。文獻報導有許多中草藥含抑制腫瘤生長、血管新生和轉移的能力，同時伴隨較少的副作用。我們先前從十五種臨床上常用的中藥複方中，篩檢出三種對非小細胞肺癌細胞具有抑制能力的複方，分別為三號、五號及十四號藥方。已知此三種複方會造成A549細胞週期停滯進而抑制細胞的生長。我們更進一步使用非小細胞肺癌細胞株H460以及H520為細胞模式，評估這三種複方是否對非小細胞肺癌細胞具有一致的抑制效果，並以A549細胞株於雄性裸鼠進行腫瘤異種移植動物模式，以評估藥方的抗癌效果。在細胞模式中，我們利用細胞存活率(MTT assay)檢測十四號複方對非小細胞肺癌細胞株H460以及H520的半致死率，分別為4.5% 跟3.8%。此外，我們也發現十四號複方具有抑制細胞群落形成，以及造成細胞週期停滯在G1與G2的現象。在異種移植動物模式中，我們投予三種複方後發現三號以及十四號複方可減少腫瘤的大小，以西方墨點轉漬法進一步探討複方藥物處理的結果，我們發現這兩種複方可能藉由將腫瘤內細胞停滯在G2細胞週期以及誘導細胞凋亡的發生。本實驗的結果提供細胞以及動物實驗模式的結果顯示三號以及十四號複方可能具有抗腫瘤的潛力。Item 中草藥 TRM01 之抗非小細胞肺癌研究(2017) 施喬偉; Shih, Jaio-Wei癌症一直是世界上致死率最高的疾病，而肺癌更是其中的佼佼者，不論是在 世界上或是台灣，肺癌都是高居十大癌症死因的榜首。根據病理學的型態分類大 致上可以將肺癌分成兩種:非小細胞肺癌(85 %)以及小細胞肺癌(15 %)。在 約 80 %非小細胞肺癌病人身上可以發現表皮細胞生長受體(EGFR)有過度活化 的現象，而導致此現象大多是由於 Exon 19 上的缺失或是 Exon 21 上的 L858R 點突變造成，這些突變會導致細胞癌化並且導致腫瘤的產生以及轉移。在現今的 治療中對非小細胞肺癌的治療主要是手術治療輔以標靶治療，隨著越來越多的小 分子藥物的開發，現在已有開發出表皮細胞生長受體的激酶抑制劑(kinase inhibitor)如 geftinib 以及 erlotinib。但是藥物的使用治療，在臨床上也發現病人 在使用抑制劑之後會在 Exon 20 產生另一個點突變 T790M，而此一突變會導致病 人產生抗藥性以及癌症復發。 科學界近年來一直致力於將中草藥開發應用於治療癌症上，因此本研究希望 可以找到治療非小細胞肺癌的中草藥。本研究從七種中草藥中找到 TRM01 具有 抑制帶有 T790M/L858R 兩種點突變的非小細胞癌細胞株 H1975 生長的中草藥， 也發現 TRM01 可以抑制 EGFR 的表現並能透過 Bcl-2/Caspase-9 訊息傳遞路徑引 起細胞的凋亡(Apoptosis)。另一方面本研究也發現 TRM01 可以透過調控 FAK 的活性來抑制 Rho-family 蛋白的活性以及抑制 EMT 蛋白(N-cadherin、 Fibronectin)的表現來降低 H1975 細胞的遷移(Migration)能力，同時也有發 現 TRM01 具有可以透過調控 AKT/mTOR 訊息傳遞(p-4EBP1、HIF1a)的表現 來抑制癌細胞血管新生的能力。此外本研究藉由動物異種移植(Xenograft)模式，將 H1975 細胞注入小鼠皮下來探討 TRM01 是否可以在活體(In vivo)內抑制腫 瘤生長，結果顯示 TRM01 可以在活體內抑制腫瘤生長。 根據以上的實驗結果，此研究證實 TRM01 具有抑制非小細胞肺癌的血管新 生以及轉移的能力及動物實驗也有抑制腫瘤生長效果，因此在往後的藥物開發以 及腫瘤治療上是具有高度潛力的中草藥物。Item 非小細胞肺癌之基因組缺失圖譜：新基因組缺失及新腫瘤抑制基因之精確定位和其變異分析(2005) 曾若嘉; Ruo-Chia Tseng中文摘要 肺癌為國人癌症死亡的首位，近年來每年約有6000人死於肺癌，但其分子致癌機制至今仍未釐清。由於癌症的形成過程中主要變異的基因為致癌基因 (Oncogenes) 活性過增或抑癌基因 (Tumor suppress genes, TSGs) 失去活性；抑癌基因經研究證明需二個基因座皆變異才導致其失去活性而致癌，其變異的方式多為一基因座產生點突變、小片段鹼基缺失、或啟動子過度甲基化 (promoter hypermethylation)，而另一基因座產生抑癌基因及鄰近區域DNA大片段的缺失，因此異質性缺失 (loss of heterozygosity, LOH) 經常可作為抑癌基因區位的指標。為了偵測肺癌組織之異質性缺失，並瞭解一些特定抑癌基因參與台灣肺癌形成之機制，本研究設計了以下三個主要目標：（1）以微切片（microdissection）取得高純度癌細胞與其配對之正常細胞進行基因體異質性缺失分析，以建立一台灣肺癌基因體異質性缺失圖譜；（2）針對缺失的高頻率區域如染色體1p36.2、10q24.3及 17q24.3所包含的三個抑癌基因ICAT、BTRCP及 AXIN2在肺癌病人中進行DNA、RNA、蛋白質變異分析；（3）針對基因體缺失區域17q24.3設計高密度之微衛星序列，以精確定出缺失區位，再進一步以肺癌細胞株及病人組織進行該區位之異常轉錄產物及啟動子甲基化分析。 目標一：本研究結果顯示以177個微衛星序列進行71位肺癌病人的基因體缺失分析，有20個染色體區位其缺失頻率可達48％以上，其中8個區位尚未有文獻報告，僅在台灣發現；卡方分析統計的結果顯示許多區位的缺失與病人的年齡、性別、抽煙狀況、癌症種類及分期有關，例如：9個微衛星序列與抽煙的病人有關（P值小於0.05）；2個微衛星序列與肺腺癌 (adenocarcinoma) 有關（P值小於0.05）。利用Cox’s多變項分析，3個區位的缺失與病人存活率顯著相關（P值小於0.05）。上述為文獻中針對肺癌最完整的全基因異質性缺失研究，這些與台灣地區非小細胞肺癌有關的異質性缺失，可能用來作為肺癌早期偵測的指標或預後的依據，同時這些區域也可用來尋找一些因為失去功能而導致非小細胞肺癌形成的新穎抑癌基因。 目標二：上述基因體異質性缺失結果顯示，染色體1p36.2、10q24.3及 17q24.3 其基因體缺失的頻率皆高於40%，這三個基因座分別包含wingless (Wnt) 訊號傳遞中的三個重要抑癌基因ICAT、BTRCP及 AXIN2；而Wnt 訊號傳遞與細胞增生、活動及癌化生成是有關連的，並與β-catenin蛋白質降解過程中扮演重要角色。為瞭解在非小細胞肺癌中，AXIN2、BTRCP及ICAT基因是否發生變異，我們利用反轉錄-聚合及免疫組織化學染色法偵測78位非小細胞肺癌及非腫瘤配對肺組織中AXIN2、BTRCP及ICAT基因之異常。研究結果顯示，分別有35%、32%及35%的病人有蛋白質表現異常之情形，其啟動子過度甲基化 (promoter hypermethylation) 亦分別有38%、50%及42%。卡方分析發現AXIN2 mRNA低表現經常發生於腫瘤分期之早期病人，其比例為53%（P值為0.028）；另外免疫組織化學染色法與卡方分析結果顯示AXIN2、BTRCP及ICAT基因蛋白低表現與啟動子過度甲基化顯著相關 (P值<0.001) 而且與β-catenin蛋白過度累積於細胞核中有顯著相關性（AXIN2，P值為0.004；BTRCP，P值為0.013）。顯示抑癌基因ICAT、BTRCP及 AXIN2變異與非小細胞肺癌形成及β-catenin蛋白過度累積有關。本研究結果亦為第一篇針對Wnt pathway之相關抑癌基因AXIN2、BTRCP及ICAT在癌症組織樣本中的完整分子及臨床研究。 目標三：基因體異質性缺失的研究顯示，染色體17q24.3 其缺失的頻率高於50%，推測此區可能有新腫瘤抑制基因。因此我們利用精確缺失定位分析17q24.3在肺癌中之情形，並且針對位於此區之新穎基因LOC51321檢測其在15株肺癌細胞株及53個肺癌組織中各有47%及36%其mRNA低表達的情形。另外，肺癌細胞株CL1-5-F4之LOC51321啟動子甲基化情形及mRNA不表達有相關性。因此推測此新穎基因LOC51321可能參與肺癌形成，且其變異與異質性缺失及啟動子過度甲基化相關。Item Application of Array-Based Epigenomic Technology for the Identification of Hypermethylated CpG Site in Lung Cancer Patients(國立臺灣師範大學生命科學學系, 2009-06-??) 張哲維; 黃培瑛; 許瀚水; 溫喬凱; 張玉生; 蘇銘燦; 王憶卿