生命科學專業學院—生命科學系
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本系學士班之教育目標為「培育優良之生物科教師及生命科學研究人才」雙軌並行。
因應少子化的衝擊，本系調整相關員額及教學資源之分配，在課程設計及學習活動上，特別注重學生基礎學識、研究能力和研究方法的訓練，使學生可依個人志趣作學習規劃，畢業後有更寬廣的出路。
本系碩、博士班之教育目標則以「培養生命科學研究人才」為主，並兼顧師資培育，故課程設計及學習活動以培養獨立研究能力為主要目標。
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Item 甲基轉移酵素在肺癌病人變異的臨床研究及分子機制以及其作為新穎標靶抗癌藥物之探討(2007) 林若凱; Ruo-Kai Lin抑癌基因的啟動子位置上若被過度甲基化，導致該基因的不表達，往往造成腫瘤的生成。負責將啟動子甲基化的酵素是甲基轉移酵素(DNA 5’-cytosine-methyltransferase, DNMT)，包括有DNMT1、DNMT3a及DNMT3b；但其在肺癌病人或細胞模式中並未有完整之變異分子機制與臨床研究，且其在癌症病人及細胞常發生不正常活化的改變，故引發出在癌症的治療中將 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。本研究在所檢測的100位非小細胞肺癌病人發現，其DNMT1、DNMT3a及DNMT3b mRNA及protein在腫瘤組織比正常肺組織有顯著過度表達的情形，P值分別有0.002、0.034 及0.027；特別是在鱗狀上皮細胞癌 (squamous carcinoma, SQ) 的病人統計發現DNMT1的蛋白有過度表達的情形，P值達0.04。當這些病人同時過度表達DNMT1及DNMT3b時，則顯示與p16INK4a、RARβ及FHIT 抑癌基因啟動子過度甲基化有關，P值達0.006。在病人的腫瘤組織採組織染色質免疫沉澱分析 (tissue chromatin immunoprecipitation) 的確發現DNMT1及DNMT3b蛋白是結合在過度甲基化的p16INK4a、RARβ及FHIT 基因啟動子上。 為了檢查DNMTs過度表達的原因，於是在肺癌細胞株H1299（不含p53基因）送入DNMTs的一個可能的負調控蛋白Wild-type p53，來了解p53對DNMTs啟動子的影響。本研究採用營火蟲冷光啟動子活性分析，發現Wild-type p53可抑制DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子活性，且在H1299肺癌細胞株長期表達Wild-type p53時，發現內生性的DNMTs之mRNA與蛋白表現量有下降的情形。而突變的p53蛋白則有增加其啟動子活性的趨勢。在病人組織樣本裡發現，這些有過度表達DNMT1的病人的確有p53 基因突變的情形，P值達0.016。這些病人同時以免疫組織染色來偵測DNMT1另一個可能的負調控蛋白RB，發現有過度表達DNMT1的病人同時伴隨著RB蛋白表達過低，P值達0.014。本研究進一步在正常的肺組織中利用組織染色質免疫沉澱分析，檢測到Wild-type p53及RB蛋白可以結合在DNMT1、DNMT3a及DNMT3b的啟動子上。DNMTs除了受轉錄的調控之外，此研究更發現DNMT1的過度表達的病人與吸煙有顯著的相關，P值達0.037。在正常肺細胞IMR-90及肺癌細胞H1299測試下發現，DNMT1、3a及3b的蛋白質表現量可受香煙致癌物4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK)的誘導而使其上升；此外，利用組織染色質免疫沉澱分析，發現在NNK處理細胞之後相較於控制組，檢測到DNMT1及DNMT3b蛋白結合在p16INK4a、RARβ及FHIT的啟動子上的程度顯著增加，該啟動子也的確被檢測是呈現過度甲基化。因此我們推測肺癌病人DNMTs的過度表達的原因可分為兩類：一是分子層次中的p53及RB變異有關，因其失去了負調控DNMT轉錄的能力；另一則是與吸煙有關，因香菸致癌物會誘導DNMTs的蛋白質表現量上升。而過度表達的DNMTs則使抑癌基因過度甲基化，最後導致肺癌的發生。 由於癌細胞基因體普遍出現CpG島群的甲基化異常而使抑癌基因失去活性的現象，因此抑制形成CpG島群的甲基化的藥物正可以作為恢復抑癌基因的表現及活化癌細胞中抑制癌症的重要路徑的新穎標靶藥物。而Mithramycin A (簡稱MMA)是一個會與富含GC及CG 序列的DNA 結合之藥物，因此本研究檢測癌細胞在經過MMA的處理之後，是否會抑制CpG島群甲基化的情形。我們發現當以低劑量(10 nM)的MMA處理癌細胞14天後，會減少轉移抑癌基因SLIT2及TIMP3的CpG島群過度甲基化的情形，並進而使這個具有抑制癌細胞轉移的SLIT2及TIMP3重現基因表達。同時間藉由膜穿透 (transwell) 實驗我們也發現MMA可降低具有高轉移能力的癌細胞CL1-5的穿越及移動能力。為了暸解MMA的作用途徑，我們使用西方點漬法發現MMA會使DNMT1蛋白明顯下降，但是DNMT1的基因表現不受影響。使用分子模擬 (molecular modeling) 發現DNMT的催化位置可被MMA藥劑所鍵結。總結研究結果發現，MMA具有去DNA甲基化及抑制癌細胞轉移的潛力。而抑制的機轉可能藉由抑制DNMT酵素催化能力並降低癌細胞中DNMT1的蛋白表達量，進而導致抑制癌細胞轉移的基因啟動子去甲基化且重新恢復表達。 本研究為首篇在肺癌病人或細胞模式針對三種主要甲基轉移酵素DNMT1, DNMT3a, DNMT3b完整之變異分子機制與臨床研究，且在肺癌細胞以GC DNA結合之MMA驗證其抑制 DNMT 作為癌症治療標靶的想法。Item 香菸致癌物透過AKT/GSK3β/βTrCP訊息路徑影響DNA甲基轉移酵素穩定性(2008) 謝翊萱; Yi-Shuan Hsieh研究背景:台灣地區不論女性或男性肺癌皆高居癌症死亡率之首位，而肺癌的發生與長期暴露於環境中的致癌物質有關，尤其是香菸中的成份nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone，簡稱NNK，被認為是造成肺癌主要的致癌物類型之一。NNK除了會導致DNA 的損害 (DNA damage) 外，近來研究也發現NNK 容易造成癌症形成過程中外顯基因變異 (epigenetic alteration)，使抑癌基因的啟動子上被過度甲基化。而造成啟動子CpG 位置上過度甲基化的DNA 甲基轉移酵素 (DNA methyltransferase, DNMT)DNMT1、DNMT 3a 及DNMT 3b，目前也已發現在癌細胞中有過度表現的情形。 研究目的: 本實驗室先前針對肺癌做了許多與抑癌基因CpG 過度甲基化相關的研究，並發現DNMTs 的過度表達與抽煙的肺癌病人有顯著的相關性，然而造成此現象的詳細機制仍不清楚。因此本篇研究目的為以細胞、臨床及動物模式探討香菸致癌物NNK 是透過何種機制而誘導DNMTs 表達，進而導致許多抑癌基因啟動子CpG位置過度甲基化的現象。 研究方法及結果: 首先在細胞模式由西方轉漬法 (Western Blot)發現處理香菸中的尼古丁 (nicotine) 6 小時後，會促使DNMT1 蛋白表現增加；而由nicotine 所衍生出來的致癌物NNK 則是在隨其處理濃度及時間增加，DNMT1 蛋白表現也隨之增加，尤其在10 μM NNK處理2 小時即有很明顯誘導效果；同時藉由外送DNMT1 載體表現分析實驗也得知NNK 會誘導外生性DNMT1 蛋白表現增加；然而透過反轉錄聚合酵素鏈反應 (RT-PCR) 得知NNK 處理2 小時並不會影響DNMT1 mRNA 的表達改變。進一步，處理可以抑制新蛋白質生成的轉譯抑制劑Cycloheximide 得知DNMT1 蛋白的半衰期大約6小時，但是同時受到NNK 刺激後，DNMT1 蛋白的半衰期增長為24 小時。本研究結果亦顯示nicotine 及NNK 在2 小時內與p-NFκB、p-AKT、p-ERK1/2 及p-p38 的訊息蛋白活化有關；更進一步由處理AKT抑制劑 (LY294002) 及AKT knock down 實驗得知NNK會透過AKT 訊息路徑影響DNMT1 蛋白表現的增加。由免疫沈澱法(Immunoprecipitation)、蛋白質降解抑制劑 (MG132) 處理等實驗證明NNK透過AKT訊息路徑影響泛素 (ubiquitin) 調節的蛋白質體降解系統而增加DNMT1 蛋白的穩定性；此外，更進一步利用GSK3β抑制劑及分別外送GSK3β、βTrCP 載體表現來驗證GSK3β/βTrCP路徑會促使DNMT1 蛋白降解，但NNK 則會活化AKT 而影響 GSK3β/βTrCP 路徑使DNMT1 不易被降解。由免疫沈澱法也首度證實DNMT1 蛋白會與GSK3β 及 βTrCP 蛋白結合，由此可知GSK3β/βTrCP 蛋白降解路徑的確會影響DNMT1 蛋白調控。接下來我們以染色質沈澱的聚合酶鏈鎖反應(chromatinimmunoprecipitation-polymerase chain reaction assay) 及聚合酵素鏈反應為基礎的甲基化分析 (methylation-specific PCR) 方法發現NNK 所誘導的DNMTs 表現會結合至抑癌基因啟動子區域，進而造成抑癌基因啟動子有過度甲基化的情形。 在動物模式實驗中，以免疫組織染色分析NNK 處理及未處理的老鼠肺組織切片，發現NNK 處理後所產生肺腫瘤組織的DNMT1、DNMT3B、p-AKT 與不活化態的p-GSK3β(ser9)蛋白表現比較高，而βTrCP 蛋白則有下降表現的情形。 在臨床研究方面，我們以免疫組織染色分析(Immunohistochemistry)偵測109 位臨床肺癌病人DNA 甲基轉移酵素表現量，發現曾經吸煙但後來有戒煙病人的DNMT1 蛋白過度表現情形 (31.1%) 比持續吸煙病人的DNMT1 蛋白過度表現情形 (69.4%) 明顯來的低 (P 值=0.001)。 結論: 由以上細胞、臨床及動物模式實驗結果顯示，香菸中致癌物NNK 的確會誘導DNMTs 蛋白表現的增加；進一步由細胞實驗結果也知NNK 會透過AKT 訊息路徑削弱GSK3β/βTrCP 調控DNMT1 蛋白降解作用，進而使DNMT1 蛋白質穩定性增加；而這些NNK 所誘導的DNMTs 蛋白也會結合到抑癌基因的啟動子位置上，進而導致抑癌基因啟動子產生過度甲基化的情形，因此成為導致肺癌發生的原因之一。